干细胞培养
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2023年3月4日发(作者：画龙点睛的意思)第1页共1页
[胚胎干细胞培养标准化操作规程]培养胚胎干
细胞
胚胎干细胞培养标准化操作规程6/28/01
目录
一、细胞
二、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态
培养基
细胞复苏
冻存细胞明胶包被
细胞传代
三、体外分化
培养基
包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板
体外分化方法
四、移植细胞的准备
细胞
多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡
1、表达绿色荧光蛋白的B5-ES细胞。由Dr、Nagy的实验室
制备。
2、D3-ATCC;CRL-19
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34、我们得到时大约传了17代。
3、J1-由Dr、Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约
传了7－9代。
4、J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr、Jaenish的实验室友
情提供。
5、表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr、Nagy的实验
室提供。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有
ESGRO的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有％明胶
的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融
合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞
接种在％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经
过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和
未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件
下培养。
培养基
ES:
配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液。分装在50ml
FALCON管中，，贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO
加入450mlDMEM中制备培养基，μm滤膜过滤。贮存于4℃。
注：一瓶DMEM是500ml。
贮存液
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DMEM
马血清
L-谷氨酰胺
MEMNEAA
HEPES
β-巯基乙醇
PEST
ESGRO
复苏细胞
细胞被冻存在10％二甲基亚砜中防止结晶的形成，结晶的形
成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细
胞复苏是很重要的。
步骤：
1、从液氮中取出一管细胞；
2、将冻存管置于37℃水浴中2分钟；
3、将细胞转移到一15mlFalcon管中；
4、加入5mlES培养基；
5、离心3分钟；
6、弃上清，用2mlES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
7、接种在明胶包被的6孔或6cm组织培养皿；
8、孵育。
冻存细胞
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冻存液
90％HS和10％二甲基亚砜
步骤：
1、1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；
2、用细胞刮刀收集细胞；
3、将细胞转入15mlFalcon管内并离心3分钟；
4、弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中
5、分装于冻存管内，每管1ml；
6、置－80℃过夜，第二天移入液氮。
明胶包被
准备500ml％明胶溶液
1、将明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中。
2、最好在溶液没有冷却的情况下通过μm滤膜过滤，贮存在
4℃。
包被培养板或培养皿
1、加入足量的明胶溶液覆盖培养平面；
2、置室温30分钟；
3、去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好
将板子平方，以免明胶污染盖子和流出培养板。
细胞传代
建议每2－3天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的
自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细
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胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有
包被的组织培养板上去除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法
中。
1、去除培养液；
2、1×无钙镁PBS洗涤；
3、加入1×胰酶EDTA37℃孵育5分钟。
4、加入ES培养基使胰酶失活；
5、将细胞转入15ml离心管中离心3min；
6、去除上清，将细胞重悬于2mlES培养基，至少吹打10－20
次。
如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES
细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重
要。这样可能会减少细胞的自然分化。
7、将细胞接种在没有包被的组织培养皿中放入温箱2小时；
8、将含有细胞的培养基转入明胶包被的组织培养皿。吹打以
确保细胞被分散开
9、建议按1：4－1：10的比率传代
保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是
好的，可以使细胞的自然分化降
到最低。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用
表1来计算传代比率。
体外分化
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多能胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们
的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选
择，在有bFGF存在的情况下扩增并最终分化在第5步。细胞全程
培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。
时间线
第2步；4＋1天
第3步；4－10天
第4步；4天
第5步；10－15天
培养基
EB
配制一20×不含DMEM，FBS，ESGRO的溶液。分装在50ml
FALCON管中，，贮存在-20℃。将21ml该溶液和50mlFBS加入
450mlDMEM中制备培养基，μm滤膜过滤。贮存于4℃。
注：一瓶DMEM是500ml。
贮存液
DMEM
胎牛血清
L-谷氨酰胺
MEMNEAA
HEPES
β-巯基乙醇
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PEST，μm滤膜过滤，贮存在-20℃。将该溶液加入DMEM/F12
中制备培养基，贮存于4℃。
贮存液
DMEM
转铁蛋白50mg/ml
胰岛素5mg/ml
亚硒酸钠300μM
黄体酮
腐胺
PEST
层粘连蛋白100μg/ml
纤维连接蛋白250μg/ml
碱性rhFGF,10μg/ml
*在第4步将bFGF加入N3培养基使终浓度为10ng/ml。
ITSFnandN3培养基贮存液的准备
使用无菌的溶剂和稀释液，在分装之前要对溶液进行过滤，
如果因为某些原因溶液在分装之前没有进行过滤，需要在管子上
标明以便别人在使用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。
贮存液溶剂，贮存液，稀释剂和储存
转铁蛋白50mg/ml
胰岛素5mg/ml
亚硒酸钠300μM
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黄体酮
腐胺
PEST
层粘连蛋白
纤维连接蛋白
碱性rhFGF,
包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板
包被液的准备
多聚-L-鸟氨酸，15μg/ml
把75ml多聚-L-鸟氨酸和425ml1×PBS混合。贮存在4℃。
纤维结合蛋白，1μg/ml
把纤维结合蛋白和500ml1×PBS混合。
包被过程：
1、加入多聚-L-鸟氨酸，至少2－3小时
2、吸出多聚-L-鸟氨酸
3、加入纤维结合蛋白，大约1－2小时
4、吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干
5、贮存在4℃
24孔板用200μl，6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能
够覆盖盖玻片或培养孔。有时需要剧烈震荡培养板。
体外分化方法
第1步：ES培养基
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在LIF存在的条件下维持细胞培养
第2步：EB培养基
使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1、分散纯化细胞
2、纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50mlFalcon
管中，计数细胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。
3、用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬
液
4、一个15cm的细菌培养皿接种4～5×106个细胞。
5、2天后更换培养基
将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上
清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6、用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培
养皿中。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步
之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状
体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的
分界。
第3步--ITSFn培养基
在最少量培养基中选择神经前体细胞
1、在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培
养基
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2、并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除
培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3、保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养
基--大约每隔一天。
观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神
经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。步骤的转换应该在神经
前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6
到第10天。
第4步－N3培养基＋bFGF
通过将神经前体细胞培养在含有10ng/mlbFGF的培养基中进
行扩增。
洗涤，加入2ml1×胰酶
2、37℃孵育5分钟
3、用4mlEB培养基终止胰酶活性，将细胞转入锥形管中放置
3～5分钟移出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。
4、将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。
5、将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片
上。24孔板接种×105/孔或6孔板×106/孔。
6、2天后更换培养基
第5步－N3培养基
通过撤除bFGF使神经前体细胞分化
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1、细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的
N3培养基
2、根据需要换液
3、分化10～15天后固定细胞
移除培养基
PBS洗涤
加入4%福尔马林
室温放置30分钟
PBS洗涤2次
储存于PBS。长期储存使用含％叠氮化纳的PBS
移植细胞的准备
细胞在胚状体形成4天以后被移植。正如在前文体外分化中
所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间
以便将胚状体移植入一10cm的培养皿。
移植
1、将胚状体转移至一15ml圆锥形管中放置3～5分钟使胚状
体沉降下来。
细胞被离心3分钟会更好。放置使之沉降将会去除更多的单
个细胞而这些细胞可以被离心下来。
2、去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1×PBS中
3、离心3分钟
4、去除上清加入1×胰酶
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5、37℃水浴5分钟
6、加入5mlEB培养基小心吹打约10次
小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹
打。
7、离心2分钟
8、吸出上清将细胞重悬于500μlEB培养基
9、用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次
10、离心2次
11、吸出上清将细胞重悬于100μlEB培养基
烟酸己可碱标记ES细胞进行移植
1、准备一10μg/ml的烟酸已可碱染液
2、加入1mg到5mlEB培养基
3、将溶液稀释成10μg/ml
4、如前所述将细胞重悬于2ml烟酸已可碱染液而不是EB培
养基中制备ES细胞悬液，
5、将悬液置于室温30分钟
6、离心2分钟
7、吸出上清将细胞重悬于2mlEB培养基
8、重复一次
9、离心2分钟
10、吸出上清将细胞重悬于100μlEB培养基并置于冰上。