血浆凝固酶试验
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2023年2月28日发(作者：城里的月光简谱)1.血浆凝固酶试验：
原理:金黄色葡萄球菌能产生结合型血浆凝固酶，可使血浆中可溶性的纤维蛋白
原变为不溶性的纤维蛋白，附着于细菌表面，在玻片上形成凝集颗粒；游离型的
血浆凝固酶则可使试管中血浆发生凝固。
大多数致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，而非致病株一般不产生。因此，血浆
凝固酶试验是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标之一。葡萄球菌产生的血浆凝
固酶有两种，一种是结合凝固酶（用玻片法测试），另一种是游离凝固酶（用试
管法检测）。
方法：（1）玻片法：在1张洁净玻片中央加1滴9g／L氯化钠(生理盐水)溶液，
用接种环取待检培养物与其混合（设阳性和阴性对照）制成菌悬液，若经10～
20s内无自凝现象发生，则加入兔新鲜血浆1环，与菌悬液混合，观察结果。
（如出现颗粒状凝集现象即为阳性。如不立即发生凝集，可稍待一，二分钟，并轻轻摇动玻
片，加速反应，若无凝集时则为阴性。）
（2）试管法：用生理盐水将新鲜兔血浆4倍稀释，取0．5ml于试管再加0.5ml
待测菌浓菌悬液（需做阳性对照及阴性对照。），混匀后置37℃水浴中，每30min
观察1次结果。若3小时内试验管和阳性对照管出现凝固，阴性对照管（即浓菌
液管）不凝固，为阳性；若阴性，继续观察到24小时，不凝固者为阴性。
（观察结果，将试管微微倾斜，血浆成冻胶样凝块者为阳性，血浆仍为液状者为阴性。）
【结果判断】（1）玻片法：5～10s内出现凝集者为阳性。（2）试管法：如有
凝块或整管凝集出现为阳性。4h后无上述现象出现，则放置过夜后再观察。
【注意事项】（1）最好使用EDTA抗凝的兔血浆，因为如果使用枸缘酸盐抗凝血
浆会产生假阳性结果（2）玻片法：10秒内观察结果，如超过10秒可出现假阳
性，因此必须用试管法验证凝聚因子试验。
2.耐热核酸酶试验
原理：致病性葡萄球菌能产生一种耐热核酸酶，它能分解DNA，使含甲苯胺蓝核
酸琼脂显示粉红色
玻片法：取融化好的甲苯胺蓝DNA琼脂3ml均匀浇在载玻片上，待琼脂凝固后打
上6-8个孔径为2-5mm的小孔，各孔分别加一滴经沸水浴3分钟处理过的待检葡
萄球菌和阳性阴性对照葡萄球菌培养物，35℃大气环境孵育3小时，观察有无粉
红色圈及其大小。
划线刺种法：将葡萄球菌24小时肉汤培养物沸水浴处理15分钟，用接种环划线
刺种于甲苯胺蓝DNA琼脂平板上，36℃±1℃培养24小时，观察刺线周围有无淡
粉红色出现。
结果：玻片法孔外出现粉红色圈的为阳性；划线刺种法在刺种线周围出现淡粉红
色为阳性。金黄色葡萄球菌耐热核酸酶阳性，表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌耐热
核酸酶阴性。
3.葡萄球菌肠毒素的测定方法
（一）反向间接血凝法（RPHA）的原理
先将各型肠毒素抗血清通过化学试剂吸附或偶联于绵羊、鸡和人“O”红血球表
面，然后再加入被检的含有相应肠毒素的标本，出现血细胞凝集即为阳性。该试
验简便、快速，检出灵敏度高，可达1ng/ml，1h-3h小时即可判定结果。
（三）检验程序
固体检样100g，加入0.85%NACL100ml，4°C浸泡18-24h，用纱布过滤；液体检
样直接吸取100ml，高速均质3min，4500r/min离心30min。吸取上清液装入透
析袋，包埋与PEG中4°浓缩过夜。用3ml生理盐水分数次将透析袋内容物洗出
将样液移入5ml离心管中，7000-8000r/min离心20min。
取上清液，加入1mol/l氢氧化钠或盐酸，调节PH为7.0。确定在同一块板上的
致敏血球的型别种类，每一种类型须各有一个阳性和阴性对照，并做好标记。
每孔加25μl样液，同时在对照孔中各加25μl阳性对照物和阴性对照物，并排
除气泡在每孔中迅速加入25μl1%的致敏血球把血凝反应板放在微量混合器上
充分混匀。取下血凝反应板，用玻璃板盖住表面置37°C。
报告。
（四）结果判定
（1）++++：血球呈均匀凝集，布满整个孔
（2）+++:血球大部分凝集，较（1）稍小
（3）++：血球50%凝集，边缘较松散，孔底有少量颗粒积沉
（4）+：血球在孔底沉淀面积较大，周围有散在的少量集。
（5）+/-：血球下沉至孔底，周围有较少凝集。
（6）-：血球下沉至孔底呈点状，边缘控齐。
一般“++”以上作为阳性结果。
(1)ELISA法
测定原理：利用双抗体夹心ELISA法，测定金黄色葡萄球菌产生的肠毒素。
方法：将金黄色葡萄球菌肠毒素抗体用0.1mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液稀释成
5ug/ml，取200ul加入聚苯乙烯酶标板每孔中，36℃孵育30分钟后用0.02mol/L
pH7.2吐温-20缓冲液洗涤五次。再加入待测标本200ul，36℃孵育60分钟后，
同上洗涤。每孔加入酶标抗体200ul,36℃孵育30分钟后，同上洗涤。加入酶反
应底物，36℃孵育30分钟后，加入2mol/L硫酸50ul。至酶标仪上读取OD值。
结果：测定空余阴性对照孔的OD比值>=2为阳性，<2为阴性。
(2)动物试验
原理：金黄色葡萄球菌产生的肠毒素是一种耐热性蛋白质，通常在100℃30分钟
不被破坏，注入动物后可产生食物中毒的症状。
方法：将金黄色葡萄球菌48小时肉汤培养物煮沸30分钟（杀死金黄色葡萄球菌
而不破坏肠毒素），并经3000r/min离心1小时后，取上清液2ml注入幼猫静脉
或腹腔，15分钟-2小时内观察幼猫的情况。
结果：幼猫发生呕吐，腹泻，体温升高，畏寒体颤等症状，表明动物肠毒素试验
阳性，无变化则为阴性。这是检测金黄色葡萄球菌是否产生肠毒素的体内试验，
可用于诊断金黄色葡萄球菌引起的人类食物中毒。
4.甘露醇发酵实验
原理：致病性葡萄球菌多能发酵甘露醇产酸，使培养基由紫色变成黄色。（原培
养基中的酚红褪去，培养基显示原本的颜色）
鉴定：将待检验菌落接种于甘露醇发酵管，35℃大气环境孵育18-24小时后观察
结果。
结果判读：培养基浑浊，由紫色变为黄色为甘露醇发酵试验阳性，仍为紫色者为
阴性。
5.触酶试验
原理：具有触酶（过氧化氢酶）的细菌，能催化过氧化氢，放出新生态氧，继而
形成分子氧，出现气泡。
操作步骤:
取3％过氧化氢溶液0.5ml，滴加于不含血液的细菌琼脂培养物上，或取1~3ml
滴加入盐水菌悬液中。
结果判断:
培养物出现气泡者为阳性。
注意事项
1.细菌要求新鲜。
2.不宜用血琼脂平板上的菌落作触酶试验，因红细胞内含有触酶，可能出现假阳
性。
3.需用已知阳性菌和阴性菌作对照。
临床意义:
在革兰阳性球菌中，肠球菌属和链球菌属触酶试验阴性，葡萄球菌属和微球菌属
阳性，因此可用于革兰阳性球菌的初步分群。