植物生理学报
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2023年2月18日发(作者：)作者简介周玮
（１９８２－），
男
，
江苏如东人
，
硕士研究生
，
研究方向
：
光
合作用
。
收稿日期２００７
!
０６
!
２０
植物叶绿体的类囊体膜上的电子传递链是产生活性氧
较活跃的部位
，
在光合电子传递的过程中
，ＰＳＩ在ＮＡＤＰ＋接
受电子能力降低时能将电子直接传递给Ｏ
２
分子
，
产生超氧
阴离子
。
超氧阴离子在超氧化物歧化酶
（ＳＯＤ）
的作用下生
成Ｈ
２
Ｏ
２
［１］。Ｈ
２
Ｏ
２
在植物体内会继续转化成其他危害更大的
活性氧如羟基自由基等［２］，
从而对植物产生伤害
。
联吡啶类
衍生物甲基紫精
（ＭｅｔｈｙｌＶｉｏｌｏｇｅｎ，ＭＶ）
是触杀灭生性除草
剂百草枯的主要成分
，
其作用机理是由于甲基紫精易于发
生单电子还原反应产生具有较低氧化还原电势的甲基紫精
自由基
，
而最终在温和的条件下诱导其他底物的还原［３］。
目
前
，
国内外大量关于植物氧化胁迫的研究都以甲基紫精作
为内源诱导物
。
但大量该类研究缺乏较为统一的处理方
法
，
尤其对水稻这种高等植物叶片
。
笔者希望建立一种甲基
紫精诱导完整叶片产生氧化胁迫对叶片无损伤的处理方法
即叶鞘引入法
。
为了将这种处理方法与已有的其他方法进
行比较
，
该试验测定了不同方法处理后叶片的叶绿素荧光
和植物蛋白
（Ｒｕｂｉｓｃｏ）
含量
，
来反映不同处理方法对叶片
光合特性的影响
。
１材料与方法
１．１植物材料水稻粤优９３８（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ，ｃｖ．ｙｕｅｙｏｕ９３８），
２００６年５￣６月分批盆播于南京农业大学温室
，
上午９：００
将５叶全展期植株连根拔下取回
。
１．２处理方法以幼苗叶片浸泡在去离子水中为对照
，
处
理后在８００μｍｏｌ／（ｍ２・ｓ）
光强下照射１ｈ，
再将叶片用湿纱布
包裹后暗适应３０ｍｉｎ，
测定叶绿素荧光参数或立刻磨样提
取Ｒｕｂｉｓｃｏ。
１．２．１浸根引入法
。
将幼苗连根泡入ＭＶ处理液
（１００μｍｏｌ／Ｌ，
下同
）
中［４－５］１ｈ。
１．２．２叶鞘引入法
。
第５叶在ＭＶ处理液中连１ｃｍ左右叶
鞘剪下
，
浸泡［６］１ｈ。
１．２．３涂抹引入法
。
用含有浓度１％Ｔｗｅｅｎ
!
２０的ＭＶ处理
液涂抹剪下浸泡在蒸馏水中的第５叶
。
１．３叶绿素荧光用脉冲调制荧光仪
（ＰＡＭ，ＷＡＬＺ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
测定
。
测量光为０．０１μｍｏｌ／（ｍ２・ｓ），
光化光３０５μｍｏｌ／（ｍ２・ｓ），
饱和脉冲光３５００μｍｏｌ／（ｍ２・ｓ），
闪光２ｓ，
间隔３０ｓ［７－８］。
１．４Ｒｕｂｉｓｃｏ含量测定参考陆巍
（２００２）
的方法进行
Ｒｕｂｉｓｃｏ的ＳＤＳ
!
ＰＡＧＥ［２］。
电泳图谱用扫描仪存入电脑
。
用
ＫｏｄａｋＤｉｇｉｔａｌＳｃｉｅｎｃｅ１Ｄ凝胶成像分析系统分析电泳图谱
中大
、
小亚基的含量
，
以中花１１为对照
（１００％）
计算突变体
在氧化胁迫下Ｒｕｂｉｓｃｏ大
、
小的相对含量
。
电泳槽采用
ＢｉｏＲａｄ公司的Ｍｉｎｉ
!
ｐｒｏｔｅａｎⅢ。
２结果与分析
２．１３种处理方法的比较Ｆｏ是光系统Ⅱ（ＰＳⅡ）
反应中
心处于完全开放时的荧光产量
；ｑＰ为光化学淬灭系数
，
表
明了ＰＳⅡ天然色素吸收的光能分配给光化学电子传递的
多少
；ｑＮ为非光化学淬灭系数［９］，
在试验中叶鞘引入处理的
叶片较其他方法略高
，
而叶鞘引入处理的叶片Ｆｍ、Ｆｖ／Ｆｍ、
Ｙｉｅｌｄ显著低于其他处理的叶片和对照
（
表１）。
这些处理之
间及与对照荧光参数的不同表明通过叶鞘引入ＭＶ后的叶
片表现出典型的氧化胁迫特征［９］。
２．２叶片对不同ＭＶ浓度的不同效应随着ＭＶ处理浓
不同甲基紫精诱导离体水稻叶片氧化胁迫方法的研究
周玮１，
张荣铣１，
李瑞１，
钟亮２，
陆巍１
（１．南京农业大学生命科学学院光合生理实验室
，
江苏南京２１００９５；２．江苏明天种业科技有限公司
，
江苏南京２１００１４）
摘要［目的］建立一种甲基紫精诱导完整水稻叶片产生氧化胁迫对叶片无损伤的处理方法
。
［
方法
］
建立叶鞘引入法
，
分别用浸根引
入法
、
叶鞘引入法和涂抹引入法处理水稻幼苗叶片后
，
测定叶片的叶绿素荧光和Ｒｕｂｉｓｃｏ含量
，
分析不同氧化胁迫诱导方法和不同处
理液浓度对诱导效果的影响
。［结果］通过叶鞘引入１００μｍｏｌ／ＬＭＶ的氧化胁迫诱导方法对水稻叶片无损伤
，
其效果比涂抹引入法和
浸根引入法要好
。
在此条件下
，２０￣４０μｍｏｌ／ＬＭＶ处理可使水稻第５叶的叶绿素荧光参数发生显著变化
。
当处理液浓度达到１００
μｍｏｌ／Ｌ时
，Ｒｕｂｉｓｃｏ含量下降约５０％。［结论］叶鞘引入法可用于以叶绿素荧光参数或Ｒｕｂｉｓｃｏ含量为标准进行水稻抗氧化胁迫突变体
的筛选
。
该方法的建立为水稻抗氧化胁迫的研究奠定了基础
。
关键词甲基紫精
；
水稻
；
氧化胁迫
；
叶绿素荧光
中图分类号Ｑ９４５．７８文献标识码Ａ文章编号０５１７－６６１１（２００７）３２－１０３１４－０２
ＳｔｕｄｙｏｎＤｉｆｆｅｒｅｎｔＭｅｔｈｏｄｓｏｆＩｎｄｕｃｉｎｇＯｘｉｄａｔｉｖｅＳｔｒｅｓｓｏｆＲｉｃｅＬｅａｖｅｓｉｎｖｉｔｒｏｂｙＭｅｔｈｙｌＶｉｏｌｏｇｅｎ
ＺＨＯＵＷｅｉｅｔａｌ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ２１００９５）
Ａｂｓｔｒａｃｔ［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］Ｔｈｅａｉｍｏｆｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｗａｓｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｋｉｎｄｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｍｅｔｈｏｄｏｆｉｎｄｕｃｉｎｇｆｕｌｌｒｉｃｅｌｅａｖｅｓｔｏｐｒｏｄｕｃｅｔｈｅｏｘｉｄａｔｉｖｅ
ｓｔｒｅｓｓｂｙｍｅｔｈｙｌｖｉｏｌｏｇｅｎｗｉｔｈｏｕｔｈａｒｍｓｔｏｌｅａｖｅｓ．［Ｍｅｔｈｏｄ］Ｌｅａｖｅ
!
ｓｈｅａｔｈｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗａｓｓｅｔｕｐ．Ｔｈｅｌｅａｖｅｓｏｆｒｉｃｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓｗｅｒｅ
ｔｒｅａｔｅｄｂｙｒｏｏｔ
!
ｓｏａｋｉｎｇｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，ｌｅａｖｅｓｈｅａｔｈｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄａｎｄｐａｉｎｔｉｎｇｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｎｄＲｕｂｉｓｃｏｃｏｎｔｅｎｔｏｆｌｅａｖｅｓａｎｄａｎａｌｙｚｅｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｄｕｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｏｌｕｔｉｏｎｏｎｔｈｅｉｎｄｕｃｔｅｄｅｆｆｅｃｔ．［Ｒｅｓｕｌｔ］Ｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｉｎｄｕｃｉｎｇ１００
μｍｏｌ／ＬＭＶｂｙｌｅａｆ
ｓｈｅａｔｈｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｈａｄｎｏｈａｒｍｔｏｒｉｃｅｌｅａｖｅｓａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｗａｓｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｒｏｏｔ
!
ｓｏａｋｉｎｇｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄａｎｄｐａｉｎｔｉｎｇ
ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｕｎｄｅｒｔｈｉｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ２０￣４０
μｍｏｌ／ＬＭＶｃｏｕｌｄｃｈａｎｇｅｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐａｒａｍｅｔｅｒｓｉｎｔｈｅ５ｔｈｌｅａｆｏｆ
ｒｉｃｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．Ｗｈｅｎｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｏｌｕｔｉｏｎｒｅａｃｈｅｄ１００μｍｏｌ／Ｌ，Ｒｕｂｉｓｃｏｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｒｅｄｕｃｅｄａｂｏｕｔｂｙ５０％．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］
Ｌｅａｖｅｓｈｅａｔｈｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｔｏｓｃｒｅｅｎｒｉｃｅｍｕｔａｎｔｓｗｉｔｈｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ．Ｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｌａｉｄ
ｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｒｉｃｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ．
ＫｅｙｗｏｒｄｓＭｅｔｈｙｌｖｉｏｌｏｇｅｎ；Ｒｉｃｅ；Ｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ；Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
安徽农业科学
，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｈｕｉＡｇｒｉ．Ｓｃｉ．２００７，３５（３２）：１０３１４－１０３１５责任编辑张杨林责任校对王淼
３结论与讨论
３．１结论试验结果表明
，
通过叶鞘引入１００μｍｏｌ／ＬＭＶ
的处理方法在不损伤水稻叶片的基础上
，
效果比涂抹和浸
根的引入方法要明显
。
在这种处理条件下
，２０￣４０μｍｏｌ／Ｌ的
ＭＶ处理就可以使水稻第５叶的叶绿素荧光参数发生显著
变化
。
而蛋白
（Ｒｕｂｉｓｃｏ）
则需要处理浓度达到１００μｍｏｌ／Ｌ才
能出现比较明显的效果
（
下降约５０％）（
图２）。
３．２讨论水稻是最重要的粮食作物之一
，
而氧化胁迫是
高等植物经常遇到的逆境
。
水稻叶片接受的光能除小部分
转化为同化力
，
并最终形成碳水化合物外
，
大部分能量通过
各种途径
，
如荧光
、
热耗散等将过剩能量耗散出去
，
防止它
们对光合机构造成损害
，
同时还有一部分过剩能量的耗散
表现为光合电子传递链通过ＰＳＩ将电子传递给氧分子
，
形
成超氧阴离子Ｏ
２
－・。Ｏ
２
－・
很不稳定
，
在ＳＯＤ的作用下易形成
Ｈ
２
Ｏ
２
。
研究结果表明
，
氧化胁迫下水稻叶片光合能力下降
，
进而造成产量的下降
。
所以研究水稻抗氧化胁迫的机理具
有十分重要的现实意义
。
该试验没有采用叶圆片真空渗入
的方法［１０］，
是因为该方法可能使叶片产生机械损伤及渗透
胁迫
，
不容易解释试验差异的来源
。
研究结果表明
，
用叶鞘
插入１００μｍｏｌ／ＬＭＶ溶液的方法比其他无损伤的处理方法
有更明显的效果
。
而如果只测定处理后叶片的叶绿素荧光
值
，
则只需测定２０￣４０μｍｏｌ／ＬＭＶ处理的叶片即可
。
如需要
测定氧化胁迫下Ｒｕｂｓｉｃｏ的变化
，
则需要１００μｍｏｌ／Ｌ的处理
浓度
。
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２８１－２９１．
［１１］林植芳
，
彭长连
，
林桂珠．Ｃ
３
，Ｃ
４
植物叶片叶绿素荧光淬灭日变化
和对光氧化作用的响应［Ｊ］．作物学报
，１９９９，２５（３）：２８４－２９０．
度的增加
，Ｆｏ的变化不明显但总的趋势是略有上升
，Ｆｍ和
Ｙｉｅｌｄ在ＭＶ浓度２０￣４０μｍｏｌ／Ｌ急剧下降
，Ｆｖ／Ｆｍ持续下
降
，２０￣４０μｍｏｌ／Ｌ和８０μｍｏｌ／Ｌ以后的变化较大
。ｑＰ与Ｙｉｅｌｄ
的变化趋势相仿
，
在２０￣４０μｍｏｌ／Ｌ急剧下降
，
以后的变化趋
于平缓
，ｑＮ在此范围内急剧上升
，
到８０以后又下降
，
可见
２０￣４０的浓度范围内
，
叶片的光合功能
（
至少是光合效率
）
发生了剧烈变化
（
图１）。
ＦｏＦｖ／ＦｍＹｉｅｌｄｑＰｑＮ
ＣＫ０．１２
±０．００７０．８２±０．０１３０．３２±０．０３００．６２±０．００５０．６６±０．０５４
浸根法０．１２±０．０１００．８２±０．０１２０．３５±０．０３６０．６３±０．０３９０．６７±０．０１０
涂抹法０．１３±０．０２２０．７６±０．０４２０．２１±０．００４０．６５±０．０２８０．７１±０．０２２
叶鞘法０．１５±０．０１００．６１±０．０２２０．１６±０．００４０．５９±０．０６７０．７２±０．０６４
表１３种处理方法与对照荧光参数的比较
周玮等不同甲基紫精诱导离体水稻叶片氧化胁迫方法的研究３５卷３２期
１０３１５