免疫荧光实验步骤

免疫荧光实验步骤

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细胞爬片免疫荧光实验步骤

第一天：

1.在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；

2.用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；

3.0.5%TritonX-100(PBS配制)室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；

浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；

5.吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；

第二天：

6.加荧光二抗：PBST浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光

二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所

有操作步骤都尽量在较暗处进行。

7.复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST5min×4次洗去多余的DAPI；8.用吸

水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

细胞免疫荧光步骤

1.在24孔板里加500微升培养基，放爬片，接种细胞（做实验以30-50%汇合度较好。10000-30000

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左右2.给药处理24h。洗三遍。

8.收集一抗，PBS洗三遍，每次5min，摇床。孵育二抗AlexaFluor488（1:1000）,室温60min（避

光）

9.回收二抗，PBS洗三遍，摇床，每次5min。

10.0.5ug/mLDAPI（5%BSA配，2滴/ml）染核15min。（避光）

洗三遍，每次5min，摇床。

12.取载玻片，滴加10uL抗荧光衰减封片剂，将爬片有细胞面盖在封片剂上，指甲油封片子的对角

线。

AllstepsforIF

1)Removeculturemediumandfixcells(acommonfixativeis4%

formaldehydeinPBS,for15minutes)

2)WashwellinPBS(3x5minutesistypical)

3)Permeabilizethecells(acommonpermeabilizationreagentis0.2%TritonX-100inPBSfor30minu

tes)

4)WashwellinPBS

5)(optional:Blockfornon-specificdyebindingusingtheImage-iTFXImageEnhancerSolution,I369

33)

6)Blockfornon-specificantibodybinding30-60minutes(acommonblockingsolutionwouldbe3-6%

bovineserumalbumin/5%normalgoatserum/PBS,orcommercialblockingreagentslikeourBlockAid

,productB10710)

7)Incubateinprimaryantibodyfor30-60minutes,inblockingsolutionorovernightat4degrees(antib

odyconcentrationsvary,butusuallybetween0.5-10ug/mL)

8)WashwellinPBS

9)Incubateinsecondaryantibodyfor30-60minutes,in3-6%bovineserumalbumin/PBS(agoodstar

tingantibodyconcentrationis5ug/mL)10)WashwellinPBS

11)Counterstainasneeded(suchaswithDAPI,D1306)

12)Mountinappropriatemountingmedium(forfluorescentsecondaries,agoodantifadesolutionisbest,

suchasProLongGold,P36934,orSlowFadeGold,S36937)