华南农业大学农学院

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立枯丝核菌不同融合群G蛋白β亚基基因克隆与分子进化分

析

舒灿伟;曹琦琦;赵美;江绍锋;周而勋

【摘要】为了揭示立枯丝核菌不同融合群菌株G蛋白β亚基基因的差异,利用同源

克隆的方法,克隆了立枯丝核菌8个融合群共13个菌株的G蛋白β亚基基因,并进

行分子进化分析.序列分析结果发现,不同融合群的立枯丝核菌的G蛋白β亚基基因

的内含子和开放阅读框数目一致,编码氨基酸均为347个.但氨基酸序列存在14个

位点的突变.同源性分析表明,立枯丝核菌各个融合群G蛋白β亚基基因之间的同源

性较高,同一亚群的菌株同源性达到100％,不同融合群之间存在差异.分子进化分析

表明,不同物种的G蛋白β亚基基因在进化上仍具有一定的保守性,不同融合群菌株

的G蛋白β亚基基因序列聚为一个分枝且与同属担子菌门的物种同源性最高.该研

究揭示了立枯丝核菌不同融合群G蛋白β亚基基因的特征,为该菌基因功能和分子

检测研究奠定了基础.%Tostudythegeneticdifferenceandmolecular

ngth

ofgDNAandcDNAsequencesofGproteinbeta-subunitgeneof13

strainsfrom8anastomosisgroups(AGs)ofRhizoctoniasolaniwere

edthat

thenumberofintronandopenreadingframeswereconsistentindifferent

isolates,whichencoded347aminoacidswith14pointmutations.

washigh,andthesimilaritypercentofisolatesfromthesameintraspecific

groupwas100％.Butthereweregeneticdiverseamongdif-ferentAGsin

logeneticanalysisindicatedthattheGproteinbeta-

subunitgenecouldeffectivelydistinguishdifferentAGs,anditalsocould

aledthe

characteristicofGproteinbeta-subunitgeneindifferentAGsfromR.

solani,andlaidthefoundationforthegenefunctionalanalysisand

moleculardetectionofthisfungus.

【期刊名称】《华北农学报》

【年(卷),期】2017(032)005

【总页数】6页(P7-12)

【关键词】立枯丝核菌;融合群;G蛋白;基因克隆;分子进化

【作者】舒灿伟;曹琦琦;赵美;江绍锋;周而勋

【作者单位】华南农业大学农学院,植物病理学系,广东省微生物信号与作物病害防

控重点实验室,广东广州510642;贵州省出入境检验检疫局,贵州贵阳550081;华

南农业大学农学院,植物病理学系,广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室,

广东广州510642;华南农业大学农学院,植物病理学系,广东省微生物信号与作物

病害防控重点实验室,广东广州510642;华南农业大学农学院,植物病理学系,广东

省微生物信号与作物病害防控重点实验室,广东广州510642

【正文语种】中文

【中图分类】Q78

丝核菌(Rhizoctoniasolani)在自然界中广泛存在于土壤及各种不同类型的寄主植

物上，引起多种植物的严重病害[1]。但它们在致病性、形态学、培养性状及生理

特征等诸多方面均有所不同。目前国际上普遍采用Ogoshi的融合群标准菌株对立

枯丝核菌进行分类[2]。到目前为止，立枯丝核菌的融合群已有14个；同一个融

合群内的菌株由于相互之间融合频率不同，或具有独特特性(如特异的寄主范围、

营养要求或分子标记在遗传上的不同)而划分为融合亚群[3-4]。

近年来，随着分子生物学及相关技术方法的迅速发展，结合菌丝融合群与分子生物

学手段对丝核菌进行研究已是主要方向[5]。G蛋白β亚基编码的蛋白作为重要的

信号传导蛋白，对致病机理起着非常重要的作用[6]。目前，全世界已利用同源克

隆的方法成功地对30多个物种G蛋白β亚基基因进行了克隆，其中哺乳动物G

蛋白β亚基基因4个，植物G蛋白β亚基基因5个，真菌G蛋白β亚基基因20

个，其他类型G蛋白β亚基基因7个，并研究了这些基因的功能[7]。在真核生物

中，G蛋白β亚基基因参与信号传导途径，导致基因表达、细胞功能受到影响[5-

8]。在植物病原真菌中，G蛋白β亚基参与了病原菌的致病过程[9-12]。

Kasahara等[13]对板栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)的研究发现，丧失β亚

基基因功能导致菌丝缺乏明显分叉，对寄主植物的侵染和致病力明显降低，并影响

孢子的形成。但目前对水稻纹枯病菌(AG-1IA)G蛋白β亚基基因功能分

析的有关报道还比较少。

本研究利用同源克隆的方法，克隆立枯丝核菌8个融合群及其亚群菌株的G蛋白

β亚基基因，分析不同融合群之间以及与其他物种的G蛋白β亚基基因之间在分

子进化上的关系，为G蛋白β亚基基因在立枯丝核菌不同融合群中的功能分析和

分子检测奠定基础。

1.1供试菌株

供试菌株为立枯丝核菌8个融合群11个融合亚群的11个国际标准融合群菌株

(AG-1IA、AG-1IB、AG-1IC、AG-2-1、AG-2-2ⅢB、AG-4、AG-5、AG-6、

AG-8、AG-9和AG-BI)以及国内分离鉴定的属于AG-1IA的强致病力菌株GD-

118和C-30，共13个菌株。其中AG-1IA(GD-118)和AG-1IA(C-30)菌株由广

东省微生物信号与作物病害防控重点实验室保存，其余菌株由日本北海道大学

Ogoshi教授惠赠。

1.2主要试剂和仪器

真菌核酸提取试剂盒(货号9765、9108)、高保真酶、克隆载体pMD20-T、大肠

杆菌JM109、反转录试剂盒等均购自TaKaRa公司；引物合成和测序由奥科生物

公司完成。PCR扩增仪veriti96-wellThermalcycle9902购自美国Torrey

PinesScientific公司；凝胶成像系统AlphaImagerEP购自美国Alpha

Innotech公司。

1.3菌株纯化及菌丝收集

将保存于斜面上的菌种移到水琼脂平板活化后，在PDA上生长2d。用内径5

mm的打孔器在菌落边沿打取菌饼，将5块菌饼接入到100mLPDB培养基中，

在28℃下振荡培养3～4d。菌丝体用无菌滤纸过滤后，用ddH2O洗涤2～3次，

吸干水分后马上用液氮冷冻，放入-80℃冰箱中保存备用。

1.4核酸提取和PCR扩增

核酸提取的具体步骤详见产品说明书。以DNA为模板，用高保真酶进行PCR扩

增，所用引物序列为：F：5′-TGGCTTGTTGGGTTGA-3′；R：5′-

TGACCACGACCAAATGAA-3′。扩增程序为：95℃预变性2min；94℃变性30

s，退火温度下复性40s，72℃延伸1min(35个循环)；72℃延伸10min；4℃

保存。同样以RNA为模板，用一步法反转录试剂盒进行RT-PCR扩增，所用引物

序列为：F：5′-ATG

TCGAACCAAGGAGATATT-3′；R：5′-TTACGCCCAGA

CCTTGAG-3′。扩增程序为：50℃30min；94℃2min；94℃30s，退火温

度下30s，72℃1min(30个循环)；72℃延伸10min；4℃保存。分别将PCR

与RT-PCR的产物切胶回收，连接到克隆载体pMD20-T，再转化到大肠杆菌

(Escherichiacoli)JM109感受态细胞。通过蓝白斑筛选和PCR验证，将阳性克隆

子送往奥科公司测序。

1.5序列分析

1.5.1分子进化分析利用DNAStar软件分析13个菌株G蛋白β亚基基因DNA

序列的相似度，并利用MEGA7软件和iIOL网站(http：///)构建13

个菌株以及与其他植物病原真菌G蛋白β亚基基因的分子进化树。

1.5.2开放阅读框和内含子分析用DNAMAN软件将13个菌株的gDNA序列和

cDNA序列进行比对，分析内含子的位置并进行氨基酸比对。用DNAStar软件查

找13个菌株G蛋白β亚基基因cDNA全长序列的开放阅读框(Openreading

frame，ORF)。

2.1核酸的提取结果

立枯丝核菌13个菌株的DNA(图1-A)和RNA(图1-B)电泳结果表明，所提取的核

酸条带完整，没有降解现象，电泳背景干净，没有杂质残留。通过微量紫外分光光

度检测，所有样品的浓度和纯度都能满足后续的研究。

2.2PCR扩增结果

PCR的扩增产物电泳结果表明，AG-1IA、AG-1IB、AG-1IC、AG-2-1、AG-2-

2ⅢB、AG-4、AG-6、AG-8、AG-9、AG-BI融合群标准菌株和GD-118、C-30

这12个菌株扩增条带大约为1800bp，而融合群AG-5标准菌株扩增条带大约

为1500bp(图2-A)；RT-PCR的扩增产物电泳结果表明，13个菌株均扩增出大

约1000bp的目的条带(图2-B)。

2.3序列比对结果分析

将PCR和RT-PCR扩增产物进行克隆测序，序列分析结果表明，13个菌株G蛋

白β亚基基因序列的总体相似性为88.93%，具有较高的同源性；其中AG-1IA

亚群的标准菌株与从我国分离到的同一个融合亚群的菌株AG-1IA(GD-118)和

AG-1IA(C-30)(均分离自水稻)的相似度达到100%。融合群/亚群AG-1IA、AG-

1IB、AG-1IA(GD-118)、AG-1IA(C-30)、AG-2-1、AG-2-2ⅢB、AG-6、AG-

8和AG-9的序列相似性达到99.55%，也表现出了很高的同源性。融合群AG-6、

AG-8、AG-9的G蛋白β亚基基因序列的相似性达到99.74%，也具有很高的同

源性。融合群AG-4和AG-5、AG-4和AG-6、AG-5和AG-6的相似性分别为

69.48%，70.63%和64.85%，同源性较低。桥梁菌株AG-BI与AG-1IA、AG-4、

AG-5、AG-6和AG-1IC的序列相似性分别81.75%，70.15%，64.44%，81.34%

和79.58%。

2.4分子进化分析

本研究采用MEGA7软件和iTOL网站分析了立枯丝核菌不同融合群菌株的G蛋

白β亚基基因与其他真菌G蛋白β亚基基因的亲缘关系。结果表明(图3)，立枯丝

核菌的13个菌株与同属于担子菌门(Basidiomycota)的玉米黑粉菌(Ustilago

maydis)聚在一个大的分枝，其分子进化关系较其他真菌门的菌较近，并且同属一

门不同属之间真菌之间表现出较近的亲缘关系，因而可知不同物种之间G蛋白β

亚基基因在进化上具有保守性。从图3还可看出，AG-BI、AG-1IC、AG-4、AG-

5这4个融合群/亚群菌株的亲缘关系较远。AG-6、AG-8、AG-9这3个融合群

可聚在一个分支，AG-1IA、AG-1IB、AG-2-1、AG-2-2ⅢB、AG-1IA(GD-

118)、AG-1IA(C-30)可分布成一支，因此它们的分子进化关系较近。

2.5G蛋白β亚基基因全长序列和内含子分析

用DNAStar软件查找开放阅读框(ORF)，得到一个完整的ORF，说明此序列是一

个G蛋白β亚基基因的全长序列。用DNAMAN软件分析13个菌株G蛋白β亚

基基因的gDNA序列和cDNA序列，发现G蛋白β亚基基因均存在4个内含子。

2.6氨基酸序列分析比对

把8个融合群13个菌株的G蛋白β亚基基因的cDNA全长序列翻译成氨基酸序

列再用DNAMAN软件进行比对，发现该基因编码347个氨基酸，比对结果表明，

存在14个氨基酸的差异，其中第27，37，83，182，222，225，233，264，

270，272，320，329位氨基酸存在1个位点的差异，而第31和35位存在2个

氨基酸位点差异(图4)。同属一个融合亚群的序列没有发生突变，序列保守性比较

强；而发生氨基酸位点差异主要是AG-4、AG-5和AG-BI这3个融合亚群。

G蛋白是细胞内一类重要的信号传导蛋白，在高等动物、简单真核生物、昆虫及植

物中普遍存在[14]。目前的研究表明，G蛋白的转膜信号的中介作用，并且对该系

统各组分的不断研究已成为生物化学和分子生物学领域的研究热点[6，13，15]。

G蛋白β亚基编码的蛋白作为重要的信号传导蛋白，在致病机理方面起着非常重

要的作用[13，16-18]。

关于植物病原真菌G蛋白β亚基基因的克隆与功能已有较多报道，这些研究发现，

真菌G蛋白β亚基主要是在病菌交配过程中起作用，也发现G蛋白β亚基功能缺

失后的菌株毒性丧失[19]。Nishimura等[20]研究发现，稻瘟菌(Magnaporthe

grisea)G蛋白β亚基基因MGB1缺失突变体会表现出产孢量下降，致病力减弱。

在尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和玉米赤霉(Gibberellazeae)中，G蛋白

β亚基基因可影响真菌毒素产生和致病力[21]。Delgado-Jarana等[22]发现，尖

孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)的G蛋白β亚基通过参与cAMP或独立于

cAMP的代谢途径控制病菌的生长、发育和致病过程。

本研究比较了立枯丝核菌8个融合群13个菌株的G蛋白β亚基基因序列，发现

它们之间相似度较高，但有些融合群的G蛋白β亚基基因之间存在一些差异。不

同融合群菌株的G蛋白β亚基基因的同源性的高低与是否为同一融合群并没有太

大的联系。融合群是根据菌丝融合测定的方法来划分的，是在生物学水平上的分类，

并不能代表其在分子水平的差异。但同一亚群菌株的G蛋白β亚基基因同源性达

到100%，说明同一融合亚群菌株之间的G蛋白β亚基基因没有出现遗传分化[2-

3]。为进一步直观揭示这些差异，本研究构建了立枯丝核菌G蛋白β亚基基因序

列的分子进化树，发现了AG-1IA、AG-1IB、AG-1IA(GD-118)、AG-1IA(C-

30)、AG-2-1、AG-2-2ⅢB为一支，进化关系比较近。AG-6、AG-8和AG-9为

一支，其进化关系最近。而AG-1IC、AG-4、AG-5和AG-BI聚为一支，亲缘关

系较远。比较立枯丝核菌不同融合群菌株与其他近缘真菌G蛋白β亚基基因的相

似性及亲缘关系的远近，结果发现立枯丝核菌和玉米黑粉菌同属于担子菌门，表现

出的亲缘关系较其他真菌门的真菌较近，并且同门真菌的属之间也表现出较近的亲

缘关系，因而可知不同物种之间G蛋白β亚基基因在进化上具有保守性，这可能

提示其功能的保守性。本研究找出了立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的4个内含子，

对立枯丝核菌不同融合群G蛋白β亚基基因的相关功能表达研究具有指导意义。

同时，本研究比较了立枯丝核菌不同融合群G蛋白β亚基基因翻译蛋白(氨基酸)

全长序列的差异，对研究立枯丝核菌不同融合群G蛋白β亚基基因的分化和分子

检测具有重要意义。

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