2024年3月27日发(作者：)
・７４６・ 临床肿瘤学杂志２０１１年８月第１６卷第８期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ａｕｇ．２０１ ｌ，Ｖｏ１．１６，Ｎｏ．８ ・综述与讲座・ Ｉ临床样本ＤＮＡ自动测序结果的判读 ２１００４６ 南京 南京中医药大学基础医学院 张树鹏 ，赖仁胜 ，杜益群 ，谢玲’，吴晓斌 【摘要】 自动测序技术向临床医学方向转化，使测序结果电泳图的正确判读成为临床分子病理学家、肿瘤学家及临 床研究者十分重要的技能之一。本文总结了自动测序结果图中单位点杂峰、杂合子、纯合子及长片段杂峰序列，以及缺火 ｊ 插入所致框移等的特点和正确判读方法，并就其发生原理、注意事项及处理方法等作一探讨。另外，结合临床实践刈‘Ｉ）ＮＡ洲 序的报告内容提出了相应的要求。 【关键词】ＤＮＡ测序；电泳图；判断；临床分子病理学 中图分类号：Ｒ７３０ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９—０４６０（２０１１）０８—０７４６—０５ Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ ｔｅｓｔ ＺＨＡＮＧ Ｓｈｕ—ｐｅｎｇ， ，Ｒｅｎ—ｓｈｅｎｇ，ＤＵ Ｙｉ—ｑｕｎ，ＸＩＥ Ｌｉｎｇ， ｆ／Ｘｉａｏ—ｂｉｎ．Ｔｈｅ Ｐｒｅ—ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２ １ ００４６，Ｃｈｉｎａ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｅａｌ ｕｓｅ ｍａｋｅｓ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｃｔ ｒｅａｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｍ。ｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ ｂｅｃｏｍｉｎｇ ａ ｖｅｒｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｓｋｉｌｌ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｏ］ｏｇｉｓｔｓ．ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ．Ｔｈｊｓ ａｒｔｉｃｌｅ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｐｅａｋｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ，ｓｉｎｇｌｅ ｐｅａｋｓ ｏｆ ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ ａｎｄ ｈｍｇ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｆｒａｍｅ—ｓｈｉｆｔ ｏｆ ｂａｓｅｓ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｌｓｏ ｇａｖｅ ａｎ ａｄｖｉｃｅ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｃ［ｒｅｅｏｇｎｉｚａｔｉｏｎ（ １ ｔｈｅｍ．Ｗｅ ａｌｓｏ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｅａｒａｎｃｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｎｏｔｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｒｅｍｏｖｉｎｇ ｔｈｅｍ．Ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ，ＳＯ）ｌｌｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ａｐｐｅａｌｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｐｏ￣ｆｏｒｍ ｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ． 【Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ】ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ； Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔ０ｇｒａｍ； Ｒｅａｄｉｎｇ； Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ 随着人类基因组计划的完成及对遗传物质认识的进一 步深入，人们对遗传物质的研究逐渐向医学临床应用方向转 化和延伸。继美国提出癌症基因组计划以来，各种基因生物 标志的研究与临床检测方兴未艾…。自１９７７年英国剑桥大 学的Ｆｒｅｄ Ｓａｎｇｅｒ及美国哈佛大学的Ａｌａｎ Ｍａｘａｍ和Ｗａｌｔｅｒ Ｇｉｂｅｒｔ两个小组同时发明了ＤＮＡ序列测定方法以来，ＤＮＡ 的测定技术发展迅速，新一代的测序技术向自动化、高灵敏、 大通量和低价格的方向发展，从而推动了临床基因检测的实 际应用 。因此自动测序结果的电泳图正确判读也成为临 床分子病理学医师和各类研究人员的一项重要工作。其中 应用最为广泛的测序方法之一就是美国ＡＢＩ公司基于四色 荧光末端终止法所形成的电泳图。我们将几年来在这类测 １ 杂峰与杂合子的判读 １．１ ＢｉｇＤｙｅ峰 ＢｉｇＤｙｅ是洲序反应过程中最重要的试剂． ．在测序反应产物的纯化过程中，如果不能有效去除，就公 测序图前１００余碱基内出现 一个或儿个多色荧光重叠 一 起的宽峰（图１）。当纯化效果很差时，ＢｉｇＤｙｅ峰可高达数 碱基，会造成后面测序峰过低，从而影响判断。解决的办法 是采用适合自已实验室的纯化方法，如优化的脚）ＴＡ＋醋酸 钠法，或采用相应公司的纯化试剂盒 。另外也可以在没汁 引物的时候尽 使突变热点区避＿』ｆ前５Ｏ个碱基，黄丁测序 质量最稳定的第１００～２００个碱基的位置 １．２钉子峰序结果电泳图判读中的一些经验总结讨论如下。 这种峰的 现 股认为足任七细管『｝ｌｆＨ ｒ 小的气泡或杂质，其出现位置不定，为变形的峰（多为变帘变 高）挤在一起，ｕ＿４种荧光颜色都有（ ２）．．钉子峰的¨｛现 基金项日：闭家中医药管理局々项资助项日（２００８７０２２） １ ２１００２９江苏省中医院病理科
・７５０・ 临床肿瘤学杂志２０１１年８月第ｌ６卷第８期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ０ｎｃｏｌ０ｇｖ，Ａｕｇ．２０１１，Ｖ（）Ｉ．１６，Ｎ０．８ 细胞内的遗传物质（ＤＮＡ）携带有生命活动的全套信息， 核苷酸的线性排列构成了ＤＮＡ的一级结构。ＤＮＡ一级结构 是认识基因结构、调节、表达和功能的基础，并可以此了解细 也应该说明检测基因的名称、突变位点类型、突变ＤＮＡ大约 的百分比及所用仪器方法及灵敏度，必要时可以与临床医帅 联系沟通。只有这样才能规范基因检测，提高相关临床人员 胞及生物的生物学特性。因此ＤＮＡ测序分析在基因的研究 中是必不可少的。随着基因组学的进一步发展，基因资源的 迅速丰富，临床医学实践迫切要求利用多种组学方法，筛选 各种生物标志，用于对疾病的发病及危险度评价、疾病诊断 与分型、治疗和预后的评估、开发新的药物及探索新的治疗 方法等。正确判读ＤＮＡ自动测序电泳图将成为临床分子病 理学医师及肿瘤科医师十分重要也是必要的技能之一，但关 对测序结果的了解，提高判读的客观性与准确性，更好地为 临床工作服务。 参考文献 ［１］ 杜益群，赖仁胜，许红英癌症基凶组研究计划慨述［Ｊ］．脱代 肿瘤医学，２００９，５，１７（５）：９９２—９９４． ［２］ 黄彦．ＤＮＡ商速测序技术及其应用ｆ Ｊ］生命科学仪器， 于这一问题的讨论很少 。首先要了解使用方法、仪器种类 型号、检测原理及其优缺点。例如荧光ＰＣＲ探针法的灵敏 度高，但结果判定非阴即阳，适合检测点突变，不能进行半定 量；焦磷酸测序法可以进行半定量，但所测序列较短等。其 次，要对实验室进行严格的质量控制，应对实验室的灵敏度 及可信度做出评估。如我科对样本据病理学形态进行肿瘤 细胞的富集，在源头上就开始把关，每批Ｋ—Ｒａｓ基因测序样 本设有野生型、突变型及空白对照，并在前期确定了灵敏度， 在突变ＤＮＡ达到样本的１０％时，结果的可信度为１００％，最 后综合突变的热点区、噪声的高低、污染的轻重等各环节的 信息对结果进行可信的判读。第三，报告时应提供原始数据 图，图上的基本信息也是质量及可信性的保证，而在报告中 ２００８，６（２）：３—６． ［３］种康，瞿礼嘉主译．ＰＣＲ技术实验指南［Ｍ］．北京：化 学Ｉ． 业出版社，２００６：６５． ［４］ 李树珍，万慧荣，杨 光ＤＮＡ池结合ＤＨＩ １ Ｃ和卣接测序技 术在江豚ＳＮＰｓ检测中的应用［Ｊ］．兽类学报，２００９，２９（２）： ｌ８５—１９０． ［５］ Ｋａｒａｐｅｔｉｓ ＣＳ，Ｋｈａｍｂａｔａ—Ｆｏｒｄ Ｓ，Ｊｏｎｋｅｒ ＤＪ，ｅｔ ａｌ Ｋ—ｒａｓ ｎｌｔｌｉａ— ｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｂｅｎｅｆｉｔ ｆｒｏｍ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃｏｌｏｒｅｅｔａｌ ｃａｎ（＇ｅｒ ［Ｊ］．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２００８，３５９（Ｉ７）：Ｉ７５７—１７６５． ［６］唐伯平， 开亚，宋大祥，等．ＤＮＡ序列判改ｒ”的几个问题 ［Ｊ］．实验室研究 探索，２００３，２２（５）：４３—４４ 收稿日期：２０１０—１２—１４；修叫日期：２０１１—０ｌ一０６
