2023年12月9日发(作者：)
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ZhejiangShiyongjun2010,18(3):16~19银耳菌种规范化生产工艺讲座丁湖广(福建省古田县新元食用菌研究所,古田 352200)(二))))银耳菌种分离方式与操作技术
关键词 银耳;菌种;分离;标准1 母种分离的种耳标准银耳母种分离的种耳,来源于野生和人工栽培。野外采集标本时,必须注意生态环境,特别是植被和植物群落组成;了解其采集地的基质、气温、地温、湿度、光照强度等,为驯化提供原始参考资料。各地科研部门驯化银耳菌种已取得成效,许多菌株已有大面积人工栽培,成为定型的速生高产菌株。现有银耳的制种,大部分是从人工栽培菌株中选择的种耳。标准的种耳应具备以下条件:¹种性稳定。经大面积栽培,普获高产优质,且无种性变异或偶变现象。º生活力强。菌丝生长旺盛,原基分化正常,出耳快,长势好;新鲜子实体耳肉厚,叶片大,展片疏松,形似牡丹花;基质和子实体无病虫害。»确定季节。种耳以春秋产季的为好,冬春产季的耳花展片差,不宜使用。¼成熟程度。通常在接种后30天左右、子实体展片成形、弹性强时采集。此时若在种耳的底部铺上一张塑料薄膜,一天后用手抚摸,有滑腻的感觉,表明已弹射担孢子。½环境考验。室内栽培的银耳,还必须将被选作种耳的菌袋搬到环境适宜的野外,考验1~2天后取回,使其适应自然环境。¾入选编号。确定被选的种耳,适时采集1~2朵,编号,并标记原菌株代号。2 孢子分离与提纯技术211 孢子的收集(1)分离前消毒。采集的种耳,表面可能带有杂菌,可用75%的酒精擦洗2~3遍,然后用无菌水冲洗数次,再用无菌纱布吸干表面水分。分离前,先要进行器皿的消毒。把烧杯、玻璃罩、培养皿、剪刀、不锈钢钩、接种针、镊子、无菌水、纱布等,一起置于高压灭菌器内灭菌。然后将酒精灯和75%酒精或011%升汞溶液,以及装有经过灭菌的琼脂培养基的三角瓶、试管和经过消毒的种耳等,放入接种箱或接种室内一并进行消毒。(2)孢子的收集方法。收集的方法具体可分整朵插种、三角瓶钩悬、试管琼脂或木屑培养基贴附3种。操作要求在无菌条件下进行。¹整耳插种法。在接种箱内,将经消毒处理的整朵种耳插入无菌孢子收集器里,再将孢子收集器置于适温下,让其自然弹射孢子。º三角瓶钩悬法。将消毒过的种耳,用剪刀剪取拇指大小的耳片,挂在钢钩上,迅速移入装有培养基的三角瓶内。耳片距离培养基约2~3厘米,不可接触到瓶壁,随手把棉塞塞入瓶口。为便于筛选,一次可以多挂几个瓶子。»试管贴附法。取一支试管,从消毒过的种耳上剪取3厘米耳片,往管内推进约3厘米,贴附在管内斜面培养基表面,管口塞好棉塞,保持棉塞与种耳间距1厘米。也可将种耳片贴附在经灭菌冷却的木屑培养基上,让耳片孢子自然散落在基料上。
丁湖广:银耳菌种规范化生产工艺讲座(二)#17#212 培养移接与提纯选育方法(1)培养移接。种耳挂瓶孢子弹射后,打开接种箱,把孢子收集器或三角瓶及时置于25e条件下培养24小时。当看到培养基上方有雾状的孢子后,再搬入接种箱内,取出钢钩和耳片,塞好棉塞,然后置于恒温箱或培养室内培养2~3天。这时在培养基的表面上,就能看到白色糊状、边缘光滑的菌落,此系银耳分生孢子。此时用接种针挑取少许,接入装有琼脂培养基的试管中继续培养,即得银耳菌丝或芽孢。采用试管或菌种瓶贴附法的,待看到雾状的孢子散落于培养基后,取出耳片,然后按照上述同样方法进行。 (2)提纯选育。弹射出来的孢子,并不是每一颗都是优质的。有的孢子未成熟,有的生长畸形,不能萌发或发芽力弱,也有的孢子发芽后菌丝蔓延困难。因此,孢子采集后还必须进行筛选提纯分离。具体方法有以下几种。¹悬浮液注射法。在接种箱内,用灭过菌的注射器吸取5毫升无菌水,注入盛有孢子的培养皿内,轻轻搅动使孢子均匀地悬浮于水中,即成孢子悬浮液;再将注射器插上长针头,吸入孢子悬浮液,让针头朝上静放几分钟,使饱满的孢子沉于注射器的下部;推去上部的悬浮液,吸入无菌水将孢子稀释;然后把装有培养基的试管棉塞拔松,针头从试管壁处插入,注入孢子悬浮液1~2滴,使其顺培养基斜面流下。然后抽出针头,塞好棉塞转动试管,使孢子悬浮液均匀分布于培养基表面。º多次稀释筛选提纯分离法。取5支试管,其中1支装10毫升蒸馏水,另4支各装9毫升蒸馏水。操作时先将孢子置于10毫升无菌水试管中,摇晃,使孢子分散成悬浮液;再用无菌注射器或吸管,吸取1毫升孢子悬浮液注入第2支试管中,摇振使其分散;然后从第1支试管中,吸取1毫升孢子悬浮液注入第3支试管。如此依次稀释到第5支试管。然后把稀释的孢子悬浮液注入试管培养基表面。»平板划线法。平板划线法是通过接种环,使孢子多方向连续在平板培养基表面划线,随着接种环的移动,使孢子得以分散。经培养后分散的单个孢子即萌发生长成单个菌落,分离获得纯种。操作时,在近酒精灯火焰处,左手拿培养皿底,右手拿接种环,灼烧接种环,冷却后蘸取少许孢子悬浮液在平板上划线。划线时要使接种环与平板表面成30~40b角轻轻接触,以腕力在表面作轻快的滑动,切勿将平板表面划破。每划毕一区,要把培养皿转动约70b角再划线。最后一区切勿与第一区的线相连接,否则达不到分离的目的。划线有扇形、连续形和方格形。把经上述方法接种的试管或培养皿及时移入恒温箱内培养。在23~25e条件下,培养5~8天,在培养基上可看到许多乳白色的芽孢菌落。选择边缘整齐、光滑,中间凸起,较大的菌落,在接种箱内移接到新的试管培养基上进行扩大繁殖,并逐一标上代号和日期,在适温条件下进行培养。当培养基上长满菌丝时,即得银耳母种。但生产中,银耳母种还必须与羽毛状香灰菌混合培养,方可成为生产用一级母种。3 组织分离技术组织分离,通常是指从子实体中分离获取菌丝。这是一种快速而又简单易行的诱变育种法,能在短期内收到较好的效果,所以常被制种户采用。银耳组织分离有两种方式,一种是从耳片中分离孢子萌发菌丝,另一种是从菌丝纽结团(白毛团)分离,获得母种。311 耳片分离法新鲜的银耳耳片表面,粘附有银耳纯菌丝和香灰菌丝,可以直接从耳片中获得银耳菌种。具体操作步骤与方法(图1)为:¹挑选种耳。可从专门培养于封闭、无杂菌菌种瓶内的银耳子实体当中,挑选出耳前白毛团健壮丰满、胶质化,形成原基快、出耳早,子实体朵形圆正,耳片肥厚,色泽洁白的作为分离材料。从这种生长于无污染基质上的健壮子实体中分离的菌种纯品率较高。也可以从银耳栽培袋的群体中,选择符合种耳标准的子实体,11出耳菌种 21耳中消毒 31冲洗 41吸干 51接种 61木屑母种图1 耳片分离示意图#18#
第18卷第3期2010
年作为分离材料,但要认真做好消毒处理。º剪取1平方厘米(约小指甲大小)左右的小耳片,置于无菌水中冲洗或用酒精擦拭耳片表面,再用纱布吸干水分后,接入预先灭好菌的瓶装木屑培养基上。一次接种30瓶以上,以供筛选。整个操作过程均在接种箱内进行。»置于23~24e下培养,并逐日观察,发现杂菌污染的,立即淘汰。待孢子散落在培养基上,萌发成白色芽孢后取出耳片,塞好瓶口棉塞。一般从耳片入瓶到芽孢出现需10~15天。当原有种耳部位出现小米粒大的白毛团后,用接种针钩取其中洁白、圆满的1粒,移接到木屑母种培养基上,在22~24e下继续培养30~35天。选其中香灰菌丝长势旺盛,黑色素分泌均匀,白毛团胶质化快,原基健壮、出耳早、朵形圆正的菌种瓶,待子实体长至拇指大小时,即成木屑母种。312 单团分离法
单团分离法速度快,可在短期内生产出大量菌种。但只能一次性使用,反复使用容易引起香灰菌丝退化,影响产量。在菌种室内选取性状符合商业化生产的菌种作为分离材料,其菌龄10天左右。要求选用培养基表层菌丝生长健壮、白毛团圆满结实,香灰菌丝生长旺盛,分泌黑色花纹清晰,无杂菌污染,无害虫的菌种。将其搬入接种箱内,打开瓶口棉塞,在众多的白毛团中,瞄准理想的一个,用接种针钩取单个白毛团,迅速移接到琼脂培养基或木屑培养基表面,每支试管或每个菌瓶移接1粒。一次移接40~50瓶,便于筛选。接种后在22~24e下,经10~15天的培养和观察,待香灰菌丝蔓延斜面,白毛团周围出现晶状或淡黄色水珠,继而形成碎米状原基时,即为琼脂母种。接种在木屑菌种瓶培养基上的白毛团,一般经30~35天培养,子实体长至拇指大时,进行选优,获得木屑母种。4 基内分离技术基内分离是从银耳子实体的基部分离出混合菌丝的一种方法。在银耳耳基内含有银耳纯菌丝和香灰菌丝,通过分离可以直接获得新的菌丝,培育成母种(图2)。411 选种消毒分离材料选择出耳早,长势快,耳片洁白、朵形圆正,子实体直径4~6厘米,无杂菌污染和病虫害的栽培袋。若是选用菌种瓶内生长的子实体,应敲破瓶子上半部,用利刀切取子实体,以耳基作为分离材料。为防止耳基内可能潜伏的杂菌和害虫为害,分离前应将栽培袋(瓶)移入0~4e冰箱内,经24小时后再用敌敌畏熏蒸,以冻死或杀死害虫和杂菌。取出后再用75%酒精进行栽培袋(瓶)及耳基表面消毒,然后连同接种工具和经过灭菌的母种培养基一起放入接种箱内。412 取基移接将割去子实体并消毒后的分离材料,在无菌条件下,用接种铲挖取耳基正下方及周围较硬的基质块,用小刀将其剖开,将切面上半部的老菌丝连同耳基一起铲除,使之露出白色菌丝,以此作为分离材料。基内菌丝块移接方法有两种:一是散接,即将基内菌丝块捣碎,反复搅拌后,用接种匙取半匙菌种,移接到木屑培养基上;二是粒接,用接种针钩取米粒大小的菌丝块,经搅拌后移接到木屑培养基上。一次接30~40瓶,以供筛选。413 培养认定接种后置于22~24e下培养3~5天,检查接种块菌丝生长情况。有的可能只长香灰菌丝,有的可能有杂菌,还有的可能只长银耳纯白菌丝。为此必须进行认真鉴别,认定纯菌后继续培养8~10天。当散接的菌种瓶内培养基表面出现许多白毛11破瓶 21取出菌丝块 31剥去木屑取基下菌丝41接入纯化培养 51单团选育图2 基内分离菌种示意图
丁湖广:银耳菌种规范化生产工艺讲座(二)#19#团,粒接的菌种块长出一簇白毛团,香灰菌丝长势健壮,培养基上出现黑色花纹时,选优去劣,进行/单团纯化0。414 选优纯化
用接种针在散接法的培养基上,钩取一个洁白丰满的白毛团,移接在经灭菌的菌瓶木屑培养基表面中央,一次移接20~30瓶。在22~24e下培养20天左右,白毛团分泌淡黄色或浅褐色水珠;继续培养10~15天,出现碎米状胶质化淡黄色的原基,并分化成子实体,前后共培养30~35天。然后按照/3110(3)中的标准优选出银耳木屑母种。如果是在琼脂斜面上培养,则要用接种针钩取一小粒菌丝块,移接到琼脂斜面上,一次可移接20~30支试管。接种后,在22~24e下培养2~3天,菌丝即恢复生长,7天后白毛团周围分泌出无色或淡黄色水珠,此时从中选优去劣,获取银耳斜面母种。415 注意事项
上述分离的银耳木屑母种和斜面母种,都是银耳纯菌丝和香灰菌丝的混合菌种。此法比较简单,但要注意做好种耳筛选、消毒工作,严格执行无菌操作,否则会把杂菌带到母种上。同时应注意分离的接种块的位置,要在耳基正下方2厘米及周围2~3厘米范围内,这是因为银耳纯菌丝生长缓慢,一般在此范围内分布密集。如果离耳基太远,虽香灰菌丝生长很多,但银耳纯菌丝极少或无,这就可能出现香灰菌丝生长快,银耳纯菌丝处于弱势甚至不长的情况。因此,凡采用基内分离的银耳母种,必须经过出耳鉴定,方可使用。5 耳木分离技术耳木分离法又称寄主分离法,是从长过银耳的野生或人工段木栽培的木头中分离菌丝而得到菌种,属于无性繁殖。分离方法简单:将两年以内的银耳种木截取一小段,用水冲洗后再用无菌水洗2~3次。将其浸在75%的酒精内数秒钟,以排除附在耳木小块上的空气。再用无菌水洗去酒精,放入011%升汞溶液中。也可采用015%~1%的次氯酸钠溶液浸泡2分钟,或用1%~2%的漂白粉液浸泡2~3分钟。这些方法都能达到杀灭表面杂菌的目的。将浸泡过杀菌剂的小块耳木,立即放在无菌水中,冲洗2~3次后,用灭过菌的解剖刀切去表层。将靠表层的木质层切成015厘米长的小块,迅速放入试管培养基斜面或盛有琼脂培养基的培养皿中,置于恒温箱内培养4~6天,待菌丝恢复生长,便可在小木块旁边挑取菌丝,移接在琼脂培养基上,经适温培养即成银耳母种。日本解除我食品19项命令检查 近日,日本厚生劳动省照会我驻日使馆称,自2010年4月1日起,解除我输日食品15个品种的19个项目命令检查,为历年来解除命令检查最多的一次。日方称,解除决定是根据这些食品进口检查实绩作出的。根据其有关规定,命令检查的解除需要在两年内超过300批次药物残留没有出现超标。这说明中方对超标项目的药物残留管理取得了明显成效。这19个项目分别为,银耳毒死蜱,香菇甲氰菊酯,鸡肉磺胺喹恶石林,桂花鱼孔雀石绿,蚬贝金霉素,鳝鱼恩诺沙星,鲫鱼恩诺沙星,养殖河豚呋喃唑酮,卷心菜毒死蜱,菜心氰戊菊酯,春菊毒死蜱,芹菜毒死蜱,白菜毒死蜱,未成熟豌豆稻瘟灵、毒死蜱、氯氰菊酯、烯酰吗啉、氟硅唑,荞麦甲胺磷。日方在照会中还称,解除命令检查后,这些项目将被实施抽查率为30%的强化进口检查,如再出现超标,将会恢复命令检查。目前,针对我输日食品,仍有35个品种63个项目被日方实施命令检查。(本刊编辑部摘编自2010141195商务快讯6第258期)
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