2023年12月4日发(作者：)
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内生真菌的生物学
吕国忠
（沈阳农业大学植物保护系 110161沈阳）
一、内生真菌的定义
二、分离技术对内生真菌类群评价的影响
三、产孢和鉴定
四、组织学
五、分类
六、生物多样性
七、生态学
八、内生真菌寄主专化性的生态学和生理学
九、内生真菌产生的次生代谢产物
十、内生真菌产生的酶
十一、展望
附录Ⅰ 植物组织中内生真菌染色方法
1 内生真菌的生物学
1993年11月15~20日在北京中科院微生物所微生物资源国家重点实验室举办了内生真菌生物学讲习班，由宋大康先生通过联合国教科文组织微生物学讲座（UNESCO，Chair in Microbiology）渠道，邀请瑞士联邦高等技术学院（Swiss Federal Institute of Technology，Eidglnossische Technische Hochschule，简称ETH）Orlando Petrini教授（Mucrobiologisches Institut，ETH-Zentium，CH-8092 Zurich，Switzerland）讲授“内生真菌生物学”。参加该讲座的有贵州农业大学、四川农业大学、北京农业大学、东北林业大学及中科院微生物所等有关单位约20名同志参加了此讲座。
近十多年来在对植物与真菌的相互关系的研究中发现，除了寄生、共生等关系外，还有许多真菌在健康植物体内和谐地生活着，这些真菌叫内生菌（Endophytes），至今我们对于植物与这类真菌之间的关系尚不明了，但可以肯定的是几乎所有的植物体内部具有内生真菌，而且内生真菌具有明显的寄主专化性，有人估计，在每种植物上就可能有2~5种寄主专化性的内生真菌，那么在现在世界上的27万至40万种的维管束植物上就至少有50~200万种内生真菌有待于我们去研究，这还不包括在其它较低等植物类型上存在的内生真菌。由于这类真菌在生境上的特殊性，一方面有很多新的分类单元（taxa）有待于我们去发现，另一方面有希望从中发现一些对人类有用的物种和菌株。因此，近几年在国际上掀起了对内生真菌的研究热潮。从文献和资料看，对 2 内生真菌研究较多的国家主要有美国、英国、加拿大、瑞士、丹麦等发达国家。在我国，宋大康先生招收的研究生正在开展这方面的研究。
一、内生真菌的定义（The Definition of Endophytic Fungi）
传统上来讲，内生真菌是在活体植物组织中生长的生物，没有造成明显的症状。按照这个定义，菌根真菌（mycorrhizal fungi）也包括在内生菌中。最近，Endophyte一词也用来包括内生细菌。Dr．Petrini的讲座仅讲气生植物组织中的内生真菌，未讲菌根植物根部内生真菌。内生真菌可分为两组：麦角菌科类的系统性杂草（clavicipitaceous
systemic grass）组，该组真菌同寄主植物可能主要以互惠共生关系（mutulistic symbionsis）存在：另一组为树木、灌木，草本植物（指非麦角菌科类杂草）上的内生真菌。
过去几年注重了内生真菌的生物学研究，在内生真菌分类、生物学及进化研究方面积累了较多的资料。通过对杂草内生真菌的生物学和生理学的深入研究，以及发现Rhabdocline parkeri对松树具有有益作用，一些学者认为”endophyte”一词同”mutualist”为同物异名，另外，在健康水稻植物上发现了Fusarium equiseti，F．oxysporium
及Phoma sorghina等病菌，从而证明了很多真菌病原菌在寄主植物上可潜伏存在，而不引起病害，或者说明在病害显症前很长一段时间潜伏存在。最近研究又发现，Stagonospora pteridiicola（壳多胞属）在欧洲橛（Pteridium aquilinum，barcken）为常见内生真菌，该菌能造成蕨叶顶端卷曲病害，但在明显健康幼嫩和成熟的植株上可分离到该菌。
有些腐生菌（saprobe）以及Fisher和Petrini（1992）称作的内生 3 腐生菌（endophytic saprobe）在寄主植物中潜伏生长，而且是一般植物组织的主要定殖者。最近Kowalski和Kehr（1992）用栓内菌（Phellophyte）描述树皮（bark）和木栓层（phellem）组织中的真菌。
前面这些例子说明，用完全互惠的概念来定义内生真菌过于简单，因此Petrini（1991）延伸了Csttoll（1986）的内生菌（endophyte）定义，将内生真菌定义为：其生活史的一个时期或长或短在寄主植物的活组织内定殖而未产生症状的一类真菌。
二、分离技术对内生真菌类群评价的影响（Some Effects of
Isolation Techniques on the Assessment of Endophyte assemblages）
评价植物上的内生真菌类群的一个重要方面是所采用的表面消毒技术，要排除表面杂菌。首先选取植物材料，用自来水冲洗，在96％的乙醇中浸1分钟，然后用1：2~1：5的NaClO水溶液消毒（因植物材料而异），然后在96％的乙醇中消毒30秒。用无菌水洗或不经无菌水洗之后置于1~2％的麦芽汁琼脂培养基（MEA）上，其中加有Stremtomycin或Tetracyline，抑制细菌生长，因植物组织中也有细菌。Bills和Polyshook（1992）证明其它培养基效果也很好，其中加或不加酵母膏，最后都能分离到许多真菌。
在内生真菌研究中，普遍采用上述表面消毒方法，而且结果可靠。此外，还有许多方法，如采用60~70％乙醇消毒，但细菌和真菌长势都很好。Dreyfiss用过乙酸（peracetic acid）作表面消毒剂，而不用NaClO。Ca（ClO2）较NaClO或过乙酸效果差。H202效果好，但要求时间短，分30或60秒，在实际操作过程中，特别是材料多时较难控制时间， 4 单纯用水洗效果不好。常加入表面活性剂（surfactant或tenside）如Tween、Triton（三硝基甲苯）、SDS（十二烷基磺酸钠），浓度为1%，效果很好。
严格表面消毒技术，杀死植物材料表面的孢子或菌丝，否则会得出错误结果，因为有很多真菌在叶表面存在，即表生真菌（epiphyte），如Cladosporium和Penicillium，主要在植物幼嫩组织上生存，表面消毒不彻底就可长出这些真菌。
文献中报道的许多内生真菌现在才知道是表生真菌，在植物组织中可营内生生长。 O’Donnell和Dickinson（1980）证明，在适宜的生态和气候条件下，在植物组织开始老化时，Alternaria alternata、Cladosporium cladosporioides、C. herbarum等叶围真菌（Phylloplane）能穿透过寄主组织后进入寄主组织中。植物组织老化时，改变了原来真正内生真菌的生态栖境，从而有利腐生真菌的生长。然而，一片叶子或木块老化并不意味着组织中发生的生化变化就能使内生腐生真菌穿透叶组织。这只说明为什么有时大量地把Cladosporium和Penicillium当作内生真菌。
Legaut et al（1989）证明，北美短叶松（Pinus banksiana）和多脂松（P．resinosa）松针上表生和内生真菌类群不同，常分离到的表生真菌都是高等植物表面上常见的一般腐生菌。同一寄主植物上的内生真菌具有高度寄主专化性（host-specificity）：很多在叶表生长的真菌有时能穿透寄主组织，从菌系（strain）水平上看，可能具有高度的寄主专化性，只有这些真菌才能成功地定殖到寄主植物的内部。然而，用 5 Cladosporium初步试验，并未能证明这个推断。
Canavesi（1987）和Legault（1989）及Cabral（1905）调查结果证明了这个假说。当植物组织开始老化时，内生真菌出现的频率下降，有些叶围真菌能定殖到植物器官中。兼性寄生的内生真菌很可能是参与落叶早期降解的主要真菌，因此。在较老的组织中经常能分离到这些真菌。
Boddy和Griffith（1989）认为，水分含量是决定内生真菌在山毛榉（beech）边材中生长的主要因子，因此，新鲜的木材组织中的内生真菌常较干过的组织中多。Chapela（1989）发现内生真菌Xylariaceae仅能少量地从木质部组织的新鲜材料中分离到。先将木质部干燥，然后进行分离，在山杨（aspan）和山毛榉上，内生真菌Xylariaceae占32~42％。在欧洲对其它树种进行了比较多的研究，发现，在分离内生真菌之前，植物材料干燥状态不同，分离的内生真菌类群明显不同，这是检测某种寄主植物中内生真菌多样性的有效方法。
三、产孢和鉴定（Sporulation and Identification）
为了鉴定内生真菌，必须诱导使其产生无性和有性繁殖结构，很多真菌在l％MEA 15~20℃几周后就可产孢，需光或黑暗，有些真菌培养时间更长，有的要求4~12个月。近紫外光（300~360nm）能诱导产孢，或加经灭菌的植物组织也能诱导产孢。香石竹琼脂培养基（carnation
agar）效果较好。经验表明，只有少数真菌不产孢。但寄主植物来讲基本是固定的。
有很多技术可用来进行内生真菌的分离，很难将方法标准化，所 6 以试验结果主要依据研究者个人判断。所以，在评价和比较试验结果时，一定想着，有很多因素，如消毒时间、试验和取样部位、分离培养基、促进产孢方法等，都会影响试验结果。
四、组织学（Histology）
Suske & Acker（1989）采用免疫法，从挪威杉（Picea abies）的无症状针叶的叶肉细胞（mosophyll）中和细胞间观察到了Lophodermium piceae的菌丝。Rhabdocline parkeri是花旗松（Pseudotsuga menziesii）的内生真菌，在细胞间紧密生长，仅局限在一个表皮细胞；Stagomospora imnnumerosa侵染灯心草（Juscus effusus），Drechslera sp．侵染J．bolanderi，二者都是胞间侵染的。Phyllosticta
abbietiana通过表皮细胞侵入，在花旗松和冷杉属（Abies）植物的叶肉细胞中形成有限侵染，然而，Phyllosticta concentrica定殖在短叶红豆杉（Taxus brevifolia）针叶上，在表皮细胞间生长，在表皮下形成菌丝网，但不进入内部组织。很多叶片习居内生真菌，如Discula umbrinella（座盘孢属）的菌丝侵入受到协迫（stress）或老化的寄主组织，明显形成皮下侵染。有些叶片习居菌，如Alternaria alternata和Cladosporium
cladosporioides在气孔下室（substomatal chamber）生长，只在叶肉细胞内形成有限侵染。
五、分类（Taxonomy）
目前报导的内生真菌多数属于子囊菌（Ascomycetes）或其无性型（anamorph），即半知菌阶段（Deuteromycetes），目前很少报导有担子菌（Basidiomycetes）阶段的真菌。之所以报导的子囊菌或半知菌较多， 7 而担子菌少，可能主要是由于所选用的培养基没有选择性，采用的培养基对能快速生长的真菌有促进作用和选择作用，故掩盖或抑制了其它真菌的生长。
内生真菌在活的寄主植物上很少产生子实体，只有当寄主植物死亡时才产生繁殖结构，其中腔孢菌产生的载孢体（conidiomata）最常见。
六、生物多样性（Biodiversity）
通常从一种植物上能分离到许多内生真菌，然而，平均来看，一种植物上有4~5种内生真菌最为常见，而且具有寄主专化性。另外，没发现哪种植物没有内生真菌，因此说明在所有植物中都有内生真菌，Hawksworth（l991）在其关于生物多样性的讨论中未就内生真菌进行过详细讨论。Dreyfuss和Chapela（1993）曾保守地估计，有待发现的内生真菌数量可能超过130万。
内生真菌存在生物多样性，说明内生真菌经过许多不同的进化途径。瘤座菌属类（Balansiae）及其无性型是典型的杂草内生真菌，向着同杂草形成互惠关系方向进化，因为该类群真菌能产生具有生理活性的生物碱（alkaloid），对某些昆虫(insect)和哺乳食草动物（mammalian
herbivore）有毒，因此，使原本无防御化合物（defensive compound）的杂草获得了产生有效化合物的抗食草动物的能力。同样，发现内生真菌Acremonium中有90%的种类在植物体内能产生抗真菌活性（anti-fungal activity）的抗生现象（antibiosis），如抗Colletotrichum
graminicola和Dechslera erythrospila真菌病。Wicklow et al (1998)发现， 8 Fusarium moniliforme为玉米内生真菌，能抑制黄曲霉菌（Aspergillus
flavus）在玉米果穗受伤处侵入后向未受伤籽粒的扩展，说明该菌能产生对A. f1avus具有活性的抗真菌物质。
同某些杂草内生真菌类似，针叶树（conifer）针叶中有些内生真菌在害虫生物防治上具有生物活性，二者间是互惠关系。
然而，有许多内生真菌同寄主植物并不形成明显的互惠关系，故常将之当作前面提到的内生腐生菌和栓内菌。有些真菌在寄主死亡时才形成无性或有性繁殖结构，说明寄主植物对内生真菌具有很强的选择压力，使其至少在生活史的早期营内生生长。不同内生腐生菌间为了争夺适宜的有机基质（organic subtrate）互相之间存在着竞争，可能就是形成这种选择压力的原因。腐生菌选择了适宜基质后，在植物死亡前处于潜伏状态，这样这些腐生菌就处于一种优势状态，一旦寄主植物开始老化（Senescence），就能迅速定殖在要死亡的或已死亡的植物组织中。
七、生态学(Ecology)
早期对好气植物组织（aerial plant tissue）内生真菌的研究，主要是经济上重要的麦角菌科类系统性杂草的内生真菌，同寄主植物形成各种程度的互惠关系。最近，从生态学和生理学角度对树木、灌木及草本植物（herb）的根和气生组织进行了深入研究。
从同一寄主组织中通常能分离到不只一种内生真菌，这说明植物组织中蕴育着（host）具有功能性组织（functional organization）的复杂的真菌类群。目前，还没有一个例子（model）来证明这种相互作用。 9 不同植物中的内生真菌类群具有较大的生物多样性，可能同内生真菌和寄主植物的生态学和生理学分化有关。观察发现。多数植物具有1-3种主要内生真菌，而且能定殖在植物的多数组织中，这说明二者在进化过程中在生理上互相适应。二者形成高度互惠关系，如杂草和Acremonium一些种的关系即如此，Acremonium主要发生在系统多年生的寄主植物上。尽管不能排除有少数菌为短暂定殖者，但在高等植物的组织中有许多具有寄主专化性的内生腐生菌。例如，在英国的河床（river estuary）的涨潮线和落潮线间生长的植物，Salicornia perennis（盐角草属），发现检查的材料中有60%具有Pleospora salicorniae（格孢腔菌属）内生真菌，但在茎和叶上报导有32种内生真菌。同样，在荆豆（Ulex europaeus）的木质部和树皮组织中约有50％组织被Phomopsis ligulata内生真菌侵染。
在同一地区生长的同种树上的内生真菌类群通常类似，但在同一寄主植物的幼嫩和老的植株上内生真菌在发生频率和分布上存在明显差异。树冠（canopy）紧密下的同源树体上取样，发现内生真菌定殖频率（colonization rate）较高，内生真菌侵染（infection）与海拨高度（elevation）和或湿度（humidity）和水分（moisture）间存在相关性，Sieber（1988）发现Tiarosporella parca倾向于定殖在海拔低、潮湿条件下生长的挪威杉的针叶上，而Lophodermium piceae经常发生在海拔高、气候干燥的地方。
对内生真菌在同一种树的空间和时间分布（spatial and temporal
pattern）进行了一些研究。一般来讲，随着组织老化，内生真菌定殖的 10 频率增加。不同时期植株上的内生真菌类群不同，同一种菌在幼嫩和老化的叶片中分布不同。随着树冠高度增加，定殖频率和种群多样性变化都明显增加；在同一树上不同方向上取样，包括叶片和枝条，未发现有任何明显差异。
Canavesi(1987)证明，在欧洲白冷杉（European white fir）针叶上有一系列微生物。在无症状绿色针叶上，内生真菌类群比较稳定和一致，然而，在枝条开始老化和变褐的针叶上会产生另一组被称为表生真菌的类群。Gourbiere(1974，1980)发现，针叶树落叶4-6周后，内生真菌类群就会被子腐生菌取代。只要针叶未开始老化。绿色无症状的针叶上真菌类群就处于平衡状态。组织逐渐老化后，腐生菌类群上升，Del
Don（1991）用北美红杉（Sequoia sempervirens）的针叶进行连续调查，至少部分证明了Canavesi的结果。
关于人为改变(anthropogenic modification）生态系统（ecosystem）后，对内生真菌种群（population）的影响还未进行全面研究，Sieber一Canacesi及Sieber（1988）报导，白冷杉针叶的内生真菌种群组成和每种真菌发生频率受当地森林管理状况影响。认真修剪（clear-cutting）和种植（plantation）会减少内生真菌的传播（transmission）。欧洲白冷杉自然繁殖（propagating spontaneously）的地方，针叶中内生真菌定殖频率较种植的地方高。大气污染物（pollutant）明显影响内生真菌类群的组成和定殖频率。Siebert和Close(1987)及Sieber(1988、1989)发现山毛榉和挪威冷杉健康和发病的树木上，内生真菌类群存在差异，说明大气污染同样影响森林和真菌 11 群体。Riesen和Close(1987)发现，在大麦田中喷洒丙环唑（propicnazole）后，大麦叶片上内生真菌的定殖率明显下降。由此看来，通过这种处理可以消灭（elimination）潜伏的以内生真菌形式生长而不表现症状的病原菌（pathogen），这就说明了为什么用杀菌剂处理明显健康的作物后，作物产量会意外增加。
表生真菌和内生真菌在植物上处于不同的栖境，在叶围生态系统中参与不同的生理学和生态学效应。表生真菌是暴露在易变化的外部环境中，而内生真菌要抵御来自活的植物细胞的抵抗反应，从而保护自己。二者在叶围生态系统中可能同样起重要作用。目前，对叶围生物的调查研究主要集中在表生和内生真菌群体上。
八、内生真菌寄生专化性的生态学和生理学（Ecological and
physiological Aspects of Host-specificity in Endophytic Fungi）
植物组织被真菌定殖是一系列复杂过程的结果，包括共生体（symbiont）对寄主的识别（recognition）、孢子的萌发（germination）、表皮的穿透（penetration）及适宜寄主的定殖（colonisation）。这些过程在植物病原物中进行过大量研究。如锈病及经济上重要的真菌病害在专化性寄主识别上积累了大量资料。过去几年，对菌根共生关系中的生理学和遗传学方面也积累了大量资料，而且这方面的研究仍在继续。在植物病原菌和菌根模式（model）中，用寄主专化性能解释多数定殖过程，至于人们较少知道的无症状的内生真菌来讲，最近才证明了寄主专化性的机制（mechanism）。
1．麦角菌科类杂草内生真菌的寄主专化性（Host-specificity in
12 Clavicipitaceous Grass Endophytes）
关于很多杂草内生真菌表现的寄主专化性的基本机制，人们知道很少，只有最近的试验才揭示了这个问题。通过人工接种实验来研究杂草和内生真菌间共生体的寄主专化性，将菌丝接种到寄主组织的伤口处，或通过不同寄主植物的同工酶基因型（isozyme genotype）分布的分析来进行研究。Leuchtmann和Clay（1993）发现，4种杂草上香柱菌（Epicloe typhina）内生真菌的菌株（isolate）间寄主范围（host range）不同，试验证明侵染亲和关系（compatibity relationship）常不是相互的（reciprocal）。然而，没有直接证据证明田间观察和种群分析资料。需要进一步研究寄主范围、寄主专化性及识别机制，这些问题对将来利用杂草内生真菌进行生物防治很关健。
2．非麦角菌科类内生真菌的寄主专化性类群（Host-specific of
non-clavicipitaceous Endophytes）
根据早期种花者（florist）的描述，发现在植物种群中建立起内生真菌需要一定的专化性。一种植物上的内生真菌种类或多或少是特异性的，不同植物，特别是分类地位相近的寄主植物上，发现的内生真菌间存在着明显交叉（0verlap）。在过去几年中，群体定位分析（community ordination nanalysis）说明，内生真菌群体在寄主种（species）的水平上具有专化性。
在同一地方生长的杜鹃科植物（Ericaceous species）常被不同的内生真菌类群定殖。对同一地方生长的欧洲赤松（Pinus sylvestris）和欧洲水青岗（Fagus sylcatica）枝条上的内生真菌研究表明，二者被不同 13 的内生真菌定殖。对其它植物的进一步研究也证明了这个推断，即每种植物上能产生高度专化的内生真菌类群。Chapela从欧洲冷杉（Abies
alba）和在欧洲冷杉上生长的槲寄生（Viscum album，mistletoe）上同时取样，也证明了这个推断。即使二者的生命距离（life-span）没有超过1厘米，事实上二者暴露在同一种接种物（inoculum）下，但二者内生真菌类群完全不同。在70个分离菌株中，重复也不超过10种真菌（fungal species）。
气生植物中的内生真菌也存在寄主专化性，对根系菌根类内生真菌的调查表明。根系内生真菌可能不存在寄主专化性，但受环境条件影响较大。
最近利用根系内生真菌，研究内生真菌类群在环境条件下的变化情况。在对欧洲桤木（Alnus glutinosa，Alder tree）的水中和陆地根系中的水生丝孢菌（aquatic hyophomycetes）调查研究表明，水生丝孢菌在水中根系的平均定殖率高达30％，而土壤中根系上只有12%，聚类（cluster）和相关分析（correspondence analysis）表明，水生和陆地生根系取样具有不同的内生真菌类群。水生丝孢菌在这种植况下，营内生真菌生活可能与夏天河流中叶片基质少引起的选择压力（selection
pressure）有关，此时水生丝孢菌孢子浓度降低到几乎检查不出来的程度。岸栖（riparlan）树如桤木属（Alnus）和柳属（Salix）树将根系浸在水中，根比叶更耐久，在落叶较少时，水中的植物根系就成为重要的营养，因此成为水生丝孢菌存活的栖境。Sridhar和Barlocher（1992）的调查研究表明，水中的根系对水生丝孢菌的存活很重要。
14 3．内生真菌引起的寄主分化：组织学（Host Specificity by
Endophytic Fungi:Histology）
营活体营养（biotrophic）寄生性（parasitic）真菌成功地侵染寄主是个复杂过程。寄主通过很多结构和化学方式阻止（prevent）和抑制（limite）寄生真菌在组织中扩展（occupation），这些机制有效地排除（exclude）多数机会性真菌（opportunistic fungi），所以，只有适应性的真菌才能突破（breach）较窄范围的寄主植物防御（defence）。
能克服寄主植物防御体系说明对寄主植物具有高度的适应能力。专化的寄生物靠附着胞（apprssoria）和其它专化性的侵染结构穿透寄主组织，真菌除了直接穿透寄主植物细胞之外，一般都产生酶和机械作用。寄主植物受到侵染（invasion）后，有些不受影响（refractory）的物质积累（accumilation），形成乳突（papilla），细胞坏死（necrosis），合成植保素（phytoalexin）。
尽管有些关于内生真菌穿透寄主组织和定殖的机制方面的资料适合不了几个例子（model），但有效的证据表明，内生真菌也具有寄主识别和穿透机制，同其它专化性真菌共生体一样。Tori et al（1992）证明，D．umbrnella的分生孢子（conidia）对寄主植物表面接触（attachment）方式不同；Chapelaret al（1991）证明，寄主组织中存在的两种单木质醇（monolignol），即水青岗酯（faguside）和丁香酯（syringuside）两种混合物能诱发草莓状炭团菌（Hypoxylon fragiforme）产生（eclosion，孵化）。Rhabdocline parkerit和Discula imbrinella分化形成附着胞，能成功地侵染寄主植物。Discula umbrnella只在寄主植物表面形成附着 15 胞，在非寄主植物或人造表面则不能形成附着胞。Viret et al（1993）认为同表面接触（contact）对D．umbrinella分生孢子萌发很关键。寄主植物叶片汁液能促进孢子萌发，在孢子悬浮液中或在人造或非寄主植物上都不能促进侵染结构分化。寄主汁液能刺激Meria laricis和R．parkeri分生孢子形成色素（pigmentation），这是附着胞分化的第一步，也是侵染成功与否的关键。
吸器是表生真菌和其它专化性寄生物普遍具有的结构，也是对寄主植物的高度适应。有人已经报导过R．parkeri和D．umbrinella具有吸器，在Lophodermiaceae中发现胞间菌丝膨大。人们已经发现D．umbrinella和R．parkeri以及其它营活体寄主物的超微结构不同，缺少典型的颈带（neckhand），但在其它营活体寄生物中存在，这反映出这两种内生真菌营活体寄生阶段短暂。在麦角菌科类杂草内生真菌中几乎观察不到吸器，但Philipson（1991）报道，在黑麦草（Lolium
perenne，ryegrass）中的粘帚霉属类（Gliocladium-like）内生真菌在老化的叶片（blade）中形成胞间菌丝，能穿透寄主细胞壁，形成窄的穿孔菌丝（perforation hyphae）。Philipson和Christey（1986）在黑麦草的麦角菌科真菌类的内生真菌中发现寄主细胞质（cytoplasm）和内生真菌的穿透结构间有一层膜，但在D．umbrinella和R．parkeri中则未发现。
内生真菌在寄主植物中的定殖方式同其它真菌共生体（symbiose），不管是互惠的还是拮抗的（antagnistic），都明显不同，尽管侵染机制很多，但开始侵染后，没有多少寄主组织被定殖。侵染初始能激活寄主 16 产生防御，从而限制内生真菌的定殖。然而没有多少证据证明寄主具有这种反应。Cabrial et al(1993)报道，Stagonospora innumetosa在灯心草(Juncus effus)的侵染位点附近细胞上形成乳突，受侵细胞有酚类和色素积累。这些内生真菌的侵染很像R．parkeri对欧洲冷杉的侵染，只局限于单个表皮细胞。R．parkeri侵染欧洲冷杉，在受侵细胞中积累的酚类多。电子密集化合物（electron-dense compound）在受侵表皮细胞中的积累，表明寄主植物对D．umbrinella存在过敏反应（hypersensitive
reaction）。
同植物病原菌一样，内生真菌具有高度的寄主专化性，但是，只能定殖内部组织，而无明显症状。内生真菌的生活史的明显特征是早早定殖在活的寄主组织中。而后是无症状（quiescence）营活体营养阶段，尽管植物被定殖的程度有限，但持续时间长。随着植物老化和受伤，营活体营养阶段逐渐被腐生阶段取代，在此阶段，寄主植物被广泛定殖，开始产孢。内生真菌通过这种方式（strategy），在机会性真菌开始定殖前，就占领寄主，并获得营养。分别表现活体寄生和腐生方式的真菌叫做半活体寄生（hemibiotroph）。这种特征性生活史方式表明寄主和寄生物间存在密切关系，由此进行进化选择，改变共生体的性质，向着极端互惠或拮抗方向进化。Caroll(1988)进行过讨论。
尽管缺乏详细研究，但组织学方面的资料为理解内生真菌的特殊生活史方式奠定了基础。关于内生真菌在寄主组织中的定殖和分布，以及穿透寄主组织和定殖机制方面的例子寄主一内生真菌系统的组织学研究表明，寄主一内生真菌共生体和其它拮抗和互惠的植物一真菌 17 共生体间可以比较。这些研究明确表明，内生真菌是一群异源的生物群（hetergenous biological group）。内生真菌的一般特征是：1．内生，至少是表生的，需活的寄主组织，并从中吸取营养；2．同寄主至少建立起短时的活体营养关系；3．受侵寄主组织不表现症状，如，在生活史中不造成病害。进一步研究内生真菌一定能揭示出寄主一寄生物关系中的真菌侵染过程的性质、寄主对侵染的反应、寄主抑制真菌的定殖机制以及代谢产物（metabolite）的互转化（interchange）。
4．内生真菌的寄主植物种的专化性（Host Species Specificity by
Endophytic Fungi）
为理解专化现象（phenomenon），必须记住两点，即建立专化性（establishment specificity），内生真菌专化地定殖在单一的经过选择的植物上；另一点是表达专化性（expression specificity），一种真菌定殖在几种寄主上，只在少数植物上形成特殊结构，通常指子实体（fiuiting
body）。
5．器官和组织专化性（Organ ad Tissue Specificity）
关于内生真菌的器官专化性首先是在小麦内生真菌和挪威冷杉内生真菌上发现的。欧洲桤木（Alnus glutinosa）的水生和土生根样被两种内生真菌类群定殖。说明器官专化性是内生真菌对作用在特定器官上的微生态（microecological）和生理条件的适应，从功能上讲，水生和陆生根系非常相似，只是在栖境上不同。
Caroll et al（1977）首先描述了内生真菌的组织专化性，因为从欧洲针叶树的叶柄（petiole）上分到很多真菌，这些真菌只局限在叶柄上， 18 从针叶远处很少能分离到这些真菌。后来在其它类型系统中也得出了类似结论。Stone（1986）发现，Rhabdocline parkeri和Phyllosticta sp．在花旗松(Pseudotsuga menxiesii)一起存在，R．parkeri只在表皮（epidermal）和皮下（hypodermal）细胞中存在，而Phyllosticta sp．只发生在叶肉细胞中。连续调查证明很多内生真菌具有一定程度的组织专化性。
6．寄主专化性对内生真菌的重要性（The Significance of Host
Specificity in Endophytes）
从理论上来讲，专化性和表达因子（determinant）能减少（tailor）内生真菌系统少犯错误（committed），具有一定的经济意义。举一个例子，有人可能错误地用被内生真菌侵染的杂草改良（reclamation）和当作草皮草（turf-grass）。内生真菌具有高度寄主专化性，用其进行生物除草比较理想。
对内生真菌的研究有力地说明，并非所有的真菌对它们的寄主植物是有害的（deleterious）或有益的（beneficial）（不管这些人为的概念意味着什么）。在利用自然种群的健康和长命（long-lived）的树木时，我们常把内生真菌类群中许多真菌当作有关寄主植物的致病菌（pathogen）。因此，病原菌和无害的（innocuous）内生真菌间的界限（delimitation）变得完全不清（blurred），至少对气生植物组织的内生真菌如此，对在没有方向性和选择压力低的情况下的植物种群来说，有过之而不及。很清楚，在内生真菌中有很多真菌在一定条件下成为病原菌，而在另一种条件下对植物无害，很可能是寄主植物的有益共 19 生体。人们在期望实际利用这种共生关系之前，一定要搞清楚内生真菌关系中的寄主专化性及其双重性质。
九、内生真菌产生的次生代谢产物（Production of Secondary
metabolites by Endohytic Fungi）
内生真菌有些分离菌株能产生次生代谢产物。已经证明Aureobasidium pullulans，Epicoccum purpurascens，Balansia spp.的内生真菌分离菌株，以及Acremonium coenophialum在体内能产生吲哚-3-乙酸（IAA）和蚓跺-3-乙腈。Bergamin-Strotz（1988）断定从烟草分离出的麻饼炭团菌(Hypoxylon serpens)的一个内生真菌分自菌株能产生细胞分裂素（cytokinin），它能促进寄主的开花过程。然而，该种真菌的其它株系却能导致烟草秧苗（seedling）萎蔫（wilting），抑制生长。Sieber
et al（1990）报道大叶槭（Acer macrophylla）枝条上的一种内生真菌，即Cryptodiaporthe hystrix(隐间座壳属)在体内实验中抑制愈伤组织（callus tissue）的生长，相反，愈伤组织能明显增加C. hystrix的生长速度。在二者接触前，就能产生真菌对愈伤组织的抑制作用和愈伤组织对真菌生长的刺激作用，说明内生真菌产生了胞外扩散性的代谢产物，影响真菌和愈伤组织的生长。
内生真菌经常定殖在非常特殊和常常不利的（hostile）小栖境（micro-habitat）中，内生真菌现在已当作新的次生代谢产物的潜在来源。很多内生真菌在培养条件下产生对人和植物病原细菌有活性的化合物。Fisher et al（1984）在小范围地检查对人病原细菌和真菌的作用时，发现从杜鹃科植物上分的内生真菌中30％以上具有抗细菌和抗真 20 菌活性，Coniothyrium和Microsphaeropsis内生真菌抗生活性（antibiotic
activity）特别强。Dreyfuss（1986）发现Pleurophomosis的内生真菌菌株具有产生青霉素N(penicillin N)的能力，从Cardamine hepptaphylla(碎米荠属)上分离到的Cryptosporiopsis内生真菌具有产生sporiofungine（孢菌素）化合物A、B和C的能力；从欧洲冷杉上分离的不产孢的内生真菌也具有这种能力。
Fisher et al（1984）发现从黑果越桔(Vaccinium mytillus)上分离的Cryptosporiopsis sp．内生真菌具有广谱（broad-spectrum抗生活性。Tscherter和Dreyfuss（1982）、Noble et al（1991）研究证明Cryptosporiopsis的内生真菌菌株能产生广谱的抗真菌的次生代谢产物。
Dreyfuss（1986）发现从南美和墨西哥分离的Xylaria spp．内生真菌和表生真菌能产生新一族的松胞菌素（cytochalasin）。最近，Brunner和Petrini（1992）检查了Xylaria spp．81个单孢菌株和内生真菌菌株，发现75％以上具有生物活性，内生真菌菌株活性最强。
很有趣的是同木本植物器官生活在一起的喜木内生真菌（xylotropic endophyte）也能产生代谢产物。Dreyfuss和Chapela（1993）在比较研究中发现，49％的喜木菌株具有生物活性，而其它被检查的真菌仅28％具有生物活性。同样调查说明喜木真菌的次生代谢产物对微生物比对高等植物更具有活性。Dreyfuss和Chapela（1993）认为，喜木内生真菌专化性的生活方式同抗虫害（insectpest）和抗病原菌的抗微生物活性（antifungal activity）有关。
21 早期就对麦角菌科类杂草内生真菌以及产生的抗食草动物的活性强的生物碱类的化学物质进行了讨论，并同各种类群内生真菌的进化关系联系在一起。Powell和Petroski（1992）在其综述文章中对生物碱及其化学结构进行了详细讨论。
十、内生真菌产生的酶（Enzyme Production by Endophytic Fungi）
同植物组织上的其它定殖者一样，内生真菌产生细胞壁降解酶（cell-wall degrading enzyme），从而突破寄主对病菌侵染的自然屏障（natural barrier）。利用很多不同寄主上分离到的分类上不同的内生真菌进行几种基质利用研究时发现，内生真菌能产生胞外酶（extracellular
enzyme），如果胶酶（pectinase）、酯酶（esterase）、纤维素酶（cellulase）及脂（肪）酶（lipase）等，令人振惊的是，内生真菌中能利用淀粉（starch）的很少。
对内生真菌酶活牲的研究得出了一些意想不到的结果，很多研究发现，同种内生真菌不同菌株间基质利用能力不同。然而，同工酶（isozyme）分析表明，来源于同种寄主上的一种内生真菌的菌株在酶活性（enzymatic activity）上具有较大的同源性（homogenous）。从而证明了在同种内生真菌内形成了寄生专化性菌系（strain）的推断。
十一、展望（0utlook）
Petrini（1990）和Petrini（1992）详细讨论了内生真菌研究在农业、生物学及工业上的前景（future）。
研究内生真菌的一个动力（thrust）一直是，将来也是，在农业中 22 探索（exploite）杂草和内生真菌的共生关系，目的在于利用内生真菌作为生物防治制剂(biocontrol agent)。然而，对内生真菌的研究也会有利于基础生物学和应用生物学。
对Chapela et al（1991）和Toti et al（1992）提出的受寄主调节（host一mediated）的识别机制进行研究以及对内生真菌种群分析有助于我们对无症状的内生真菌以及植物病原菌的寄主专化性和种群生物学的认识。
目前，生物学家们正在探索对农业和制药（pharmaceutic）研究有用的能产生新的代谢产物和酶的内生真菌。我相信，在不久的将来一定会得出有价值的结果。
最近研究结果表明，内生真菌可用作寄主生活力（vitality）和污染物的指示物（indicator），可用于监测大气污染。
最后，对新的寄主上内生真菌类群的深入研究会显著增加我们对真菌生物多样性的认识。可以肯定，内生真菌研究是真菌学中最迷人的领域之一。
23 附录Ⅰ 植物组织中内生真菌染色方法
1．细胞核荧光染色试剂（reagent）：4ˊ6ˊ-二氨基嘧啶-2-苯基吲哚（DAPI，4’6’-diamidino-2-phenylindote）、（acridine orange）、光神霉素（mithramycin）。
2．细胞核非荧光染色试剂：酸性品红（acid fuchsin）、盐酸-吉姆沙（HCl-Giemsa）、盐酸-乙酰地衣红（HCl—aceto-orcein）。
3．植物组织上或内部真菌菌丝染色：荧光染色法用氟化钙高碘酸-副品红染色法（periodicacid-Schiff staining，PAS）。
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